SARS

Nature Band 592, Seiten 277–282 (2021)Diesen Artikel zitieren

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Das Spike-Protein des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist durch die Beteiligung des menschlichen ACE2-Proteins1 von entscheidender Bedeutung für die Virusinfektion und ein wichtiges Antikörperziel. Hier zeigen wir, dass eine chronische Infektion mit SARS-CoV-2 bei einer immunsupprimierten Person, die mit Rekonvaleszenzplasma behandelt wird, zu einer Virusentwicklung und einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern führt, indem wir über 23 Zeitpunkte, die sich über 101 Tage erstrecken, ultratiefe Sequenzen des gesamten Genoms erzeugen und verwenden In-vitro-Techniken zur Charakterisierung der durch Sequenzierung aufgedeckten Mutationen. Nach zwei Behandlungszyklen mit Remdesivir in den ersten 57 Tagen gab es kaum Veränderungen in der Gesamtstruktur der Viruspopulation. Nach der Rekonvaleszenz-Plasmatherapie beobachteten wir jedoch große, dynamische Veränderungen in der Viruspopulation, mit der Entstehung eines dominanten Virusstamms, der eine Substitution (D796H) in der S2-Untereinheit und eine Deletion (ΔH69/ΔV70) in der S1-N-Untereinheit enthielt. terminale Domäne des Spike-Proteins. Da passiv übertragene Serumantikörper abnahmen, verringerte sich die Häufigkeit von Viren mit dem Escape-Genotyp, bevor sie während einer letzten, erfolglosen Behandlung mit Rekonvaleszenzplasma wieder zurückkehrten. In vitro verlieh die Spike-Doppelmutante, die sowohl ΔH69/ΔV70 als auch D796H trug, eine leicht verringerte Empfindlichkeit gegenüber Rekonvaleszenzplasma und behielt gleichzeitig Infektiositätsniveaus bei, die denen des Wildtyp-Virus ähnelten. Die Spike-Substitutionsmutante D796H schien der Hauptverursacher der Abnahme zu sein Anfälligkeit für neutralisierende Antikörper, diese Mutation führte jedoch zu einem Defekt der Infektiosität. Die Spike-Deletionsmutante ΔH69/ΔV70 wies eine doppelt so hohe Infektiosität auf wie der Wildtyp-SARS-CoV-2, was möglicherweise die verringerte Infektiosität der D796H-Mutation kompensierte. Diese Daten zeigen eine starke Selektion auf SARS-CoV-2 während der Rekonvaleszenz-Plasmatherapie, die mit dem Auftreten viraler Varianten verbunden ist, die Hinweise auf eine verringerte Anfälligkeit für neutralisierende Antikörper bei immunsupprimierten Personen zeigen.

Ein über siebzigjähriger Mann wurde im Sommer 2020 in ein tertiäres Krankenhaus eingeliefert und war 35 Tage zuvor mittels quantitativer Reverse-Transkription-PCR (RT-qPCR) in einem Nasopharyngealabstrich (Tag 1) in einem örtlichen Krankenhaus positiv auf SARS-CoV-2 getestet worden (Erweiterte Daten Abb. 1, 2). Zu seiner Krankengeschichte gehörte ein im Jahr 2012 diagnostiziertes marginales B-Zell-Lymphom mit vorheriger Chemotherapie einschließlich Vincristin, Prednisolon, Cyclophosphamid und Anti-CD20-B-Zell-Depletion mit Rituximab. Es ist wahrscheinlich, dass sowohl die Chemotherapie als auch das zugrunde liegende Lymphom zur kombinierten Immunschwäche von B- und T-Zellen beitrugen (Erweiterte Daten, Abbildungen 2, 3 und Ergänzungstabelle 1). Die Computertomographie des Brustkorbs zeigte weit verbreitete Anomalien, die mit einer Lungenentzündung im Zusammenhang mit der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) vereinbar waren (ergänzende Abbildung 1). Die Behandlung umfasste zwei 10-tägige Remdesivir-Kurse mit einer 5-tägigen Pause dazwischen (Erweiterte Daten, Abb. 1). An den Tagen 63 und 65 wurden zwei Einheiten Rekonvaleszenzplasma verabreicht (Extended Data Abb. 3). Nach der klinischen Verschlechterung wurden am 95. Tag Remdesivir und eine Einheit Rekonvaleszenzplasma verabreicht, die Person starb jedoch am 102. Tag (Ergänzende Anmerkung).

Bei den meisten Proben handelte es sich um Atemwegsproben aus Nase und Rachen oder um endotracheale Aspirate während der Intubationsperiode (Ergänzungstabelle 3). Die Zyklusschwellenwerte (Ct) lagen zwischen 16 und 34 und alle 23 Atemwegsproben wurden erfolgreich mit einem standardmäßigen Einzelmolekül-Sequenzierungsansatz gemäß dem ARTIC-Protokoll sequenziert, das von The COVID-19 Genomics UK (COG-UK; https://www .cogconsortium.uk/) Konsortium; Von diesen Proben wurden 20 zusätzlich einer Short-Read-Deep-Sequenzierung mit der Illumina-Plattform unterzogen (Ergänzungstabelle 4). Es bestand eine allgemeine Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden (Extended Data Abb. 4). Aufgrund der höheren Zuverlässigkeit von Illumina für Niederfrequenzvarianten wurde dies jedoch für die formale Analyse verwendet2,3. Darüber hinaus wurde die Einzelgenom-Amplifikation und Spike-Sequenzierung unter Verwendung von extrahierter RNA aus Atemwegsproben als unabhängige Methode zum Nachweis der beobachteten Mutationen verwendet (Extended Data, Abb. 4). Schließlich haben wir auf der Grundlage zweier unabhängiger Methoden keine Hinweise auf eine Rekombination festgestellt (Daten nicht gezeigt).

Die Maximum-Likelihood-Analyse von vom Patienten abgeleiteten Gesamtgenom-Konsensussequenzen zeigte eine Clusterbildung mit anderen lokalen Sequenzen aus derselben Region (Abb. 1). Der infizierende Stamm wurde der Linie 20B zugeordnet, die die Spike-Variante (D614G) trägt. Umweltproben ergaben Hinweise auf Viren auf Oberflächen wie dem Telefon und der Klingel. Die Sequenzierung dieser Oberflächenviren zeigte eine Häufung mit Viren aus dem Atemtrakt (Extended Data Abb. 2). Bei allen Proben konnte festgestellt werden, dass sie aus einer einzigen zugrunde liegenden Viruspopulation stammten. In unsere phylogenetische Analyse haben wir sequentielle Sequenzen von drei anderen lokalen Patienten einbezogen, bei denen über einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger eine anhaltende virale RNA-Ausscheidung festgestellt wurde, sowie von zwei kürzlich gemeldeten langfristig immunsupprimierten Personen mit SARS-CoV-24,5 (Erweiterte Daten). Abb. 2 und Ergänzungstabelle 2). Während die Sequenzen der drei lokalen Patienten sowie einer der vorherigen Studien5 nur geringe Divergenz und keine Aminosäureveränderungen im Spike-Protein im Laufe der Zeit zeigten, zeigte der Fallpatient (im Folgenden Patient X1) eine erhebliche Divergenz. Der andere, zuvor gemeldete Patient4 zeigte einen ähnlichen Diversifizierungsgrad wie Patient X1. Eine weitere Untersuchung der Sequenzdaten deutete auf die Existenz einer zugrunde liegenden Struktur der Viruspopulation bei Patient Das Verhältnis der abweichenden Proben zu denen zu früheren Zeitpunkten spricht gegen eine Superinfektion.

Der zirkularisierte phylogenetische Maximum-Likelihood-Baum basiert auf der Wuhan-Hu-1-Referenzsequenz und zeigt eine Teilmenge von 250 lokalen SARS-CoV-2-Genomen von GISAID. Dieses Diagramm verdeutlicht die beträchtliche Diversität von Patient Alle „britischen/englischen“ SARS-CoV-2-Genome wurden aus der GISAID-Datenbank heruntergeladen und eine zufällige Teilmenge von 250 Sequenzen als Hintergrund ausgewählt (schwarz dargestellt).

Alle Proben wurden mittels RT-qPCR positiv auf SARS-CoV-2 getestet und es gab keine nachhaltige Veränderung der Ct-Werte während der 101 Tage nach den ersten beiden Behandlungszyklen mit Remdesivir (Tage 41 und 54) oder den ersten beiden Einheiten Rekonvaleszenzplasma mit polyklonalem Medikament Antikörper (Tage 63 und 65) (Extended Data Abb. 3). Insbesondere war es uns nicht möglich, Viren aus gelagerten Abstrichproben zu kultivieren. Konsenssequenzen aus Short-Read-Deep-Sequencing-Illumina-Daten zeigten dynamische Populationsveränderungen nach Tag 65, wie in einem Highlighter-Plot dargestellt (Extended Data Abb. 6). Darüber hinaus konnten wir über den gesamten Zeitraum auch die Dynamik der Viruspopulationen bis hin zu niedrigen Frequenzen verfolgen (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 4). Nach der Behandlung mit Remdesivir am Tag 41 zeigte die Analyse der Niederfrequenzvarianten vorübergehende Aminosäureveränderungen in Populationen mit einer Häufigkeit von unter 50 % im offenen Leserahmen (ORF) 1b, 3a und Spike, mit einer C27509T-Mutation (die eine T39I-Substitution verursacht) in orf7a Erreichen von 79 % am Tag 45 (Abb. 2 und ergänzende Informationen). Wir fanden heraus, dass eine I513T-Substitution (kodiert durch T2343C) in NSP2 und eine V157L-Substitution (kodiert durch G13936T) in RdRp von einer nicht nachweisbaren Häufigkeit am Tag 54 auf eine Häufigkeit von fast 100 % am Tag 66 übergegangen war (Abb. 2), mit der Mutation in der Polymerase ist der plausiblere Kandidat für diesen Sweep. Bemerkenswert ist, dass Spike(N501Y) – das die Affinität für den ACE2-Rezeptor6 erhöhen kann und in der britischen B1.1.7-Linie7 vorhanden ist – am 55. Tag mit einer Häufigkeit von 33 % beobachtet wurde, aber durch den Sweep des NSP2 und eliminiert wurde RdRp-Variante.

Die Daten basieren auf Illumina-Short-Read-Ultra-Deep-Sequencing-Werten bei 1.000-facher Abdeckung. Die gezeigten Varianten erreichten in mindestens zwei Proben eine Häufigkeit von mindestens 10 %. CP, Rekonvaleszenzplasma; RDV, Remdesivir. Im Text beschriebene Aminosäuresubstitutionen werden durch Markierungen gekennzeichnet, die dieselbe Farbe wie die Position im Genom haben (zugehörige Proteine ​​sind für jeden Namen enthalten). Beschriftete Varianten werden durch gestrichelte Linien dargestellt. a, Varianten, die bei Patient X1 an den Tagen 1–82 nach dem ersten positiven RT-qPCR-Test auf SARS-CoV-2 entdeckt wurden. Spike(D796H*) (hellblau) hat die gleiche Frequenz wie NSP3(K902N) (orange) und ist daher unter der orangefarbenen Linie verborgen. b: Varianten, die bei Patient X1 an den Tagen 82–101 entdeckt wurden.

Im Gegensatz zur frühen Infektionsphase wurde zwischen dem 66. und 82. Tag nach den ersten beiden Verabreichungen von Rekonvaleszenzseren eine Verschiebung der Viruspopulation beobachtet, wobei eine Variante eine D796H-Substitution in S2 und eine ΔH69/ΔV70-Deletion in S2 trug Die N-terminale S1-Domäne (NTD) von Spike wird am Tag 82 zur dominanten Population. Dies wurde in einer Nasen- und Rachenabstrichprobe mit hoher Viruslast identifiziert, was durch einen Ct-Wert von 23 angezeigt wird (Abb. 3a). Die Deletion wurde vorübergehend zu Studienbeginn anhand einer Short-Read-Deep-Sequenzierung festgestellt. Die ΔH69/ΔV70-Deletion war auf eine Deletion von sechs Nukleotiden außerhalb des Rahmens zurückzuführen, die dazu führte, dass sich die Sequenz von Codon 68 von ATA zu ATC änderte.

a: Zu Studienbeginn fehlten alle sechs Spike-Varianten (Illumina-Sequenzierung) mit Ausnahme von Spike (ΔH69/ΔV70) (weniger als 1 % und weniger als 20 Lesevorgänge). Ungefähr zwei Wochen nach Erhalt von zwei Einheiten Rekonvaleszenzplasma stiegen die Viruspopulationen, die Spike (ΔH69/ΔV70) und Spike (D796H) trugen, auf Häufigkeiten von mehr als 80 %, gingen jedoch 4 Tage später deutlich zurück. Diese Population wurde durch eine Population mit Spike (Y200H) und Spike (T240I) ersetzt, die in zwei Proben über einen Zeitraum von 6 Tagen nachgewiesen wurde. Diese Viruspopulationen wurden dann durch virustragende Spike(W64G) und Spike(P330S) ersetzt, die beide am Tag 93 dominierten. Nach einer dritten Behandlung mit Remdesivir und einer zusätzlichen Einheit Rekonvaleszenzplasma wurden Spike(ΔH69/ΔV70) und Spike( Die Viruspopulation D796H) trat wieder zum dominanten Virusstamm auf und erreichte Variantenhäufigkeiten von mehr als 75 %. Mutationspaare traten gleichzeitig auf und verschwanden, was auf eine Verknüpfung desselben viralen Haplotyps hindeutet. Ct-Werte aus Atemwegsproben werden auf der rechten Y-Achse angezeigt (schwarze gestrichelte Linie und Dreiecke). In Fällen, in denen es am selben Tag zu doppelten Messungen kam, wurden zur Wahrung der Konsistenz Proben aus Nasen- und Rachenabstrichen aufgezeichnet. b, Maximum-Likelihood-Phylogenetischer Baum von Patient X1 mit Angabe des Stichtags. Spike-Mutationen, die jede der Kladen definieren, werden auf den Zweigen, auf denen sie entstanden sind, angestammt angezeigt. An Daten, an denen mehrere Proben entnommen wurden, werden diese als Endotrachealaspirat (ETA) und Nasen- und Rachenabstrich (N+T) angegeben.

An den Tagen 86 und 89 wurden aus Proben der oberen Atemwege gewonnene Viren durch die Spike-Doppelmutante (Y200H, T240I) charakterisiert, wobei das am 82. Tag beobachtete Mutations-Deletions-Paar (Spike (D796H, ΔH69/ΔV70)) auf Häufigkeiten abgenommen hatte von 10 % oder weniger (Abb. 2, 3). Spike (Y200H, T240I) wurde mit hoher Häufigkeit von drei anderen nicht-synonymen Varianten mit ähnlichen Allelfrequenzen begleitet, die für I513T in NSP2, V157L in RdRp und N177S in NSP15 kodierten (Abb. 2a). Beides wurde auch zuvor mit einer Häufigkeit von mehr als 98 % in der Stichprobe am Tag 66 beobachtet (Abb. 2a), was darauf hindeutet, dass diese neue Abstammungslinie aus einer zuvor existierenden Population hervorgegangen ist.

Durch die Sequenzierung einer Nasen- und Rachenabstrichprobe am Tag 93 wurden Viren identifiziert, die durch einen Spike(P330S) am Rand der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und einen Spike(W64G) im S1-NTD mit nahezu 100-prozentiger Häufigkeit gekennzeichnet sind, während Spike( D796H, ΔH69/ΔV70) zeigten eine Häufigkeit von weniger als 1 % und die Varianten Spike(Y200H) und Spike(T240I) hatten Häufigkeiten von weniger als 2 %. Viren mit der Spike-Variante (P330S) wurden in zwei unabhängigen Proben von verschiedenen Probenahmestellen nachgewiesen, was gegen die Möglichkeit einer Kontamination spricht. Die Abweichung dieser Stichproben vom Rest der Bevölkerung (Abb. 2, 3b und erweiterte Daten Abb. 5, 6) legt die Möglichkeit nahe, dass es sich um eine unterteilte Subpopulation handelt.

Muster in den Variantenhäufigkeiten deuten auf eine Konkurrenz zwischen Viruspopulationen mit unterschiedlichen Mutationen hin; Viren mit dem Mutation-Deletion-Paar-Spike (D796H, ΔH69/ΔV70) stiegen während der Rekonvaleszenz-Plasmatherapie stark an, wurden dann aber ohne Therapie von einer anderen Population verdrängt. Insbesondere stimmen diese Daten mit einer Abstammungslinie von Viren mit der NSP2(I513T)- und RdRp(V157L)-Variante überein, die am Tag 66 dominant war, während der Therapie jedoch durch die Mutations-Deletions-Variante verdrängt wurde. Mit dem Ende der Therapie erlangte der ursprüngliche Stamm – der NSP15 (N1773S) und die Spike-Variante (Y200H, T240I) erworben hatte – wieder die Dominanz, woraufhin eine separate Population mit der Spike-Variante (W64G, P330S) entstand.

In einem letzten Versuch, die Viruslast zu reduzieren, wurden ein dritter Gang Remdesivir (Tag 93) und eine dritte Dosis Rekonvaleszenzplasma (Tag 95) verabreicht. Wir beobachteten das Wiederauftreten der Spike-Viruspopulation (D796H, ΔH69/ΔV70) (Abb. 2, 3). Die abgeleitete Verknüpfung von Spike(D796H) und Spike(ΔH69/ΔV70) blieb erhalten, was durch die sehr ähnlichen Häufigkeiten der beiden Varianten belegt wird, was darauf hindeutet, dass die dritte Einheit Rekonvaleszenzplasma zum Wiederauftreten dieser Population unter erneuter positiver Selektion führte . Zur weiteren Unterstützung unserer vorgeschlagenen Konkurrenzidee schienen die Häufigkeiten dieser beiden Varianten Veränderungen in der NSP2(I513T)-Variante widerzuspiegeln (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass diese Varianten Marker für gegensätzliche Kladen in der Viruspopulation sind. Die Ct-Werte blieben während dieses gesamten Zeitraums mit Hyperinflammation niedrig, was schließlich zu Multiorganversagen und Tod am Tag 102 führte. Der wiederholte Anstieg der Häufigkeit der Viruspopulation unter Rekonvaleszenz-Plasmatherapie unterstützt stark die Hypothese, dass die Kombination von Deletion und Mutation im Spike-Protein verschaffte einen selektiven Vorteil.

Mittels lentiviraler Pseudotypisierung erzeugten wir Wildtyp-Spike-, Spike- (D796H, ΔH69/ΔV70)- und einzelne mutierte Spike-Proteine ​​in umhüllten Virionen, um die Neutralisierungsaktivität von Rekonvaleszenzplasma gegen diese Viren zu messen (Abb. 4). Es hat sich gezeigt, dass dieses System im Allgemeinen ähnliche Ergebnisse liefert wie replikationskompetente Viren8,9. Das Spike-Protein jeder Mutante wurde in pelletierten Virionen nachgewiesen (Abb. 4a). Wir verwendeten auch einen HIV-1(p24)-Antikörper, um das Ausmaß der Produktion lentiviraler Partikel zu überwachen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 2). Anschließend maßen wir die Infektiosität der Pseudoviren, korrigierten den Viruseintrag mithilfe von Messungen der Reverse-Transkriptase-Aktivität und stellten fest, dass Spike(ΔH69/ΔV70) im Vergleich zum Wildtyp-Spike über eine einzelne Infektionsrunde hinweg offenbar eine doppelt so hohe Infektiosität aufwies (Abb . 4b und erweiterte Daten Abb. 7). Im Gegensatz dazu hatte die Spike-Einzelmutante (D796H) eine deutlich geringere Infektiosität im Vergleich zum Wildtyp-Spike-Protein und die Doppelmutante (Spike(D796H, ΔH69/ΔV70)) hatte eine ähnliche Infektiosität wie die Wildtyp-Spike-Proteine ​​(Abb. 4b und). Erweiterte Daten Abb. 7).

a: Western-Blot von Viruspellets nach Zentrifugation von Überständen von Zellen, die mit lentiviralen Pseudotypisierungsplasmiden transfiziert wurden, die das Spike-Protein enthielten. Blots sind repräsentativ für zwei unabhängige Transfektionen. b, Einzelrunden-Infektiosität von Luciferase-exprimierenden Lentiviren, pseudotypisiert mit dem Spike-Protein (Wildtyp (WT) oder Mutant) von SARS-CoV-2 in HEK293T-Zellen, die mit ACE2- und TMPRSS2-Plasmiden co-transfiziert wurden. Die Infektiosität wird um die durch qPCR gemessene Reverse-Transkriptase-Aktivität im Virusüberstand korrigiert. Datenpunkte stellen technische Replikate dar (n = 3). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung zweier unabhängiger Experimente. RLU, relative Lichteinheiten; nU, Nanoeinheit. c–e, Neutralisierungsstärke von Rekonvaleszenzplasmaeinheiten (CP1–CP3) gegen pseudotypisierte Viren mit Spike (D796H), Spike (ΔH69/ΔV70) und Spike (D796H, ΔH69/ΔV70). f, g, Neutralisierende Wirksamkeit des Serums von Patient An den angegebenen Tagen wurde Patientenserum entnommen. Dargestellt ist die Serumverdünnung, die erforderlich ist, um 50 % der Virusinfektion (ID50) zu hemmen, ausgedrückt als fache Veränderung im Vergleich zum Wildtyp-Virus. Datenpunkte stellen Mittelwerte technischer Replikate (horizontale Balken) dar, die in unabhängigen Experimenten erhalten wurden (n = 2–6).

Quelldaten

Wir fanden heraus, dass Spike (D796H) allein und die Spike-Doppelmutante (D796H, ΔH69/ΔV70) weniger empfindlich auf Neutralisierung durch Rekonvaleszenzplasmaproben reagierten (Abb. 4c – e und Extended Data Abb. 7). Im Gegensatz dazu verringerte die einzelne Spike-Mutante (ΔH69/ΔV70) die Neutralisationsempfindlichkeit nicht. Darüber hinaus zeigte das vom Patienten stammende Serum aus den Tagen 64 und 66 (einen Tag vor und nach der Infusion mit der zweiten Rekonvaleszenz-Plasmatherapie) ebenfalls eine geringere Wirksamkeit gegen die Spike-Doppelmutante (D796H, ΔH69/ΔV70) (Abb. 4f, g). .

Zuvor wurde festgestellt, dass eine Gruppe von neunzehn monoklonalen Antikörpern, die von drei Spendern isoliert wurden, SARS-CoV-2 neutralisieren kann. Um festzustellen, ob die in vivo aufgetretenen Mutationen (Spike(D796H) und Spike(ΔH69/ΔV70)) zu einer globalen Änderung der Neutralisierungsempfindlichkeit führten, testeten wir neutralisierende monoklonale Antikörper, die auf die sieben zuvor beschriebenen Hauptepitopcluster abzielten (mit Ausnahme von). nicht neutralisierende Cluster II und V und die kleinen (n ≤ 2) neutralisierenden Cluster IV und X). Die acht RBD-spezifischen monoklonalen Antikörper (Extended Data Abb. 8) zeigten keine wesentliche Änderung der Neutralisierungsstärke und der nicht RBD-spezifische Antikörper COVA1-21 zeigte eine drei- bis fünffache Verringerung der Wirksamkeit gegen Spike(D796H, ΔH69/ΔV70). ) und Spike(ΔH69/ΔV70), jedoch nicht gegen Spike(D796H) allein9 (Extended Data Abb. 8). Wir beobachteten keine Unterschiede in der Neutralisierung zwischen Einzel- oder Doppelmutanten und dem Wildtyp-Spike-Protein, was darauf hindeutet, dass der Fluchtmechanismus wahrscheinlich außerhalb dieser Epitope in der RBD lag. Diese Daten bestätigen die Spezifität der Ergebnisse aus Rekonvaleszenzplasma und legen nahe, dass die beobachteten Mutationen mit Antikörpern zusammenhängen, die auf Regionen außerhalb der RBD abzielen. Bemerkenswerterweise zeigten Spike(ΔH69/ΔV70)-haltige Viren eine verringerte Neutralisierungsempfindlichkeit gegenüber dem monoklonalen Antikörper COVA1-21, der auf ein noch undefiniertes Epitop außerhalb des RBD10 abzielte.

Um zu verstehen, wie Spike(ΔH69/ΔV70) und Spike(D796H) Antikörperresistenz verleihen könnten, haben wir untersucht, wie sich diese Mutationen auf die Spike-Struktur auswirken könnten (Extended Data Abb. 9). Wir basierten diese Analyse hauptsächlich auf einer Struktur ohne stabilisierende Modifikationen (PDB 6XR8)11, bezogen uns aber auch auf stabilisierte Strukturen, die bei verschiedenen pH-Werten ermittelt wurden12. ΔH69/ΔV70 befindet sich in einer ungeordneten, glykosylierten Schleife an der distalen Oberfläche des NTD, nahe der Bindungsstelle polyklonaler Antikörper, die aus COV57-Plasma stammen13,14 (Extended Data Abb. 9). Da diese Schleife flexibel und gut zugänglich ist, könnte ΔH69/ΔV70 grundsätzlich die Antikörperbindung in dieser Region beeinflussen. D796 befindet sich in der Nähe der Basis des Spike-Proteins in einer Oberflächenschleife, die in der Präfusionskonformation strukturell ungeordnet ist und Teil einer großen ungeordneten Region im S2-Trimer nach der Fusion wird11 (Extended Data Abb. 9). Es wird angenommen, dass die Schleife, die den Rest 796 enthält, von Antikörpern angegriffen wird15, obwohl Mutationen an Position 796 relativ selten sind (Extended Data Abb. 9). In den RBD-Down-Spike-Strukturen11,12 bildet D796 Kontakte mit Resten im benachbarten Protomer, einschließlich des glykosylierten Restes N709 (Extended Data Abb. 9).

Hier haben wir eine wiederholte evolutionäre Reaktion von SARS-CoV-2 in Gegenwart einer Antikörpertherapie im Verlauf einer persistierenden Infektion bei einem immungeschwächten Wirt dokumentiert. Die Beobachtung einer potenziellen Selektion für spezifische Varianten, die mit dem Vorhandensein von Antikörpern aus Rekonvaleszenzplasma zusammenfällt, wird durch den experimentellen Befund der zweifach verringerten Anfälligkeit dieser Viren gegenüber Rekonvaleszenzplasma, das polyklonale Antikörper enthält, gestützt. In diesem Fall war das Auftreten der Variante nicht der Hauptgrund für das Scheitern der Behandlung.

Wir stellten in unserer Analyse anhand der in Proben der oberen Atemwege gewonnenen Sequenzen Anzeichen einer kompartimentierten Virusreplikation fest. Sowohl populationsgenetische als auch Kleintierstudien haben gezeigt, dass es während einer Infektion zu keiner Reassortierung zwischen Influenzaviren innerhalb eines einzelnen Wirts kommt, was darauf hindeutet, dass eine akute respiratorische Virusinfektion durch räumlich unterschiedliche Viruspopulationen gekennzeichnet sein könnte16,17. Bei der Datenanalyse ist es wichtig, genetische Veränderungen, die in der primären Viruspopulation auftreten, von offensichtlichen Veränderungen zu unterscheiden, die sich aus der stochastischen Beobachtung räumlich unterschiedlicher Subpopulationen im Wirt ergeben. Obwohl sich die Proben, die wir an den Tagen 93 und 95 der Infektion entnommen haben, genetisch von den anderen Proben unterscheiden, stimmen die übrigen Proben damit überein, dass sie aus einer konsistenten Viruspopulation stammen. Wir stellen fest, dass der Nachweis viraler RNA in postmortalem Gewebe zuvor nicht nur im Lungengewebe, sondern auch in Milz, Leber und Herz beobachtet wurde4. Die Vermischung von Viren aus verschiedenen Kompartimenten – beispielsweise über Blut oder die Bewegung von Sekreten vom unteren in den oberen Atemtrakt – könnte zu Schwankungen der Viruspopulationen an bestimmten Probenahmestellen führen.

Da es sich um einen Einzelfallbericht handelt, können nur begrenzte Schlussfolgerungen zur Generalisierbarkeit gezogen werden.

Eine wichtige Einschränkung besteht darin, dass die Daten aus Proben aus den oberen Atemwegen und nicht aus den unteren Atemwegen stammen, wodurch die Rückschlüsse auf die Viruspopulationen bei diesem einzelnen Patienten eingeschränkt sind.

Zusätzlich zur Dokumentation des Auftretens von SARS-CoV-2-Spike (ΔH69/ΔV70) in vivo zeigen wir in einem Pseudotypisierungstest, dass diese Variante die Infektiosität des Spike-Proteins geringfügig erhöht. Die Deletion wurde gleichzeitig mit dem seltenen Anstieg der S2-Variante (D796H) nach zwei getrennten Rekonvaleszenzplasmazyklen beobachtet, wobei andere Viruspopulationen auftauchten. D796H, jedoch nicht ΔH69/ΔV70, führte zu einer Verringerung der Anfälligkeit gegenüber polyklonalen Antikörpern in den verabreichten Einheiten Rekonvaleszenzplasma, obwohl wir nicht über ihre individuelle Wirkung auf Seren anderer Personen spekulieren können. Es ist bemerkenswert, dass die Prävalenz der Spike-Doppelmutante (D796H, ΔH69/ΔV70) zwischen den Rekonvaleszenzplasmazyklen abnahm, was darauf hindeutet, dass in der Zwischenzeit andere selektive Kräfte im Spiel waren, die möglicherweise durch die beim Individuum beobachtete Entzündung verursacht werden. Dies schließt die Möglichkeit ein, dass der Spike-Haplotyp (D796H, ΔH69/ΔV70) in dieser Zwischenzeit Mutationen in anderen Regionen getragen hat, die schädlich waren. Obwohl sich ΔH69/ΔV70 mit hoher Geschwindigkeit ausbreitet18, nehmen auch D796-Mutationen zu. D796H wurde in 0,02 % der globalen Sequenzen dokumentiert und D796Y kommt in 0,05 % der globalen Sequenzen vor (Extended Data Abb. 9).

Es ist unwahrscheinlich, dass die hier festgestellten Auswirkungen von Rekonvaleszenzplasma auf die Virusentwicklung bei immunkompetenten Wirten zutreffen, bei denen die Virusvielfalt aufgrund einer besseren Immunkontrolle wahrscheinlich geringer ist. Unsere Daten zeigen, dass Maßnahmen zur Infektionskontrolle möglicherweise auf die Bedürfnisse von immungeschwächten Patienten zugeschnitten werden müssen und auch Vorsicht bei der Interpretation der Richtlinien der US-amerikanischen Centers of Disease Control geboten ist, die 20 Tage als Obergrenze für Vorsichtsmaßnahmen zur Infektionsprävention bei immungeschwächten Patienten empfehlen sind fieberfrei19. Aufgrund der Schwierigkeit, klinische Isolate zu kultivieren, ist die Verwendung von Ersatzexperimenten gerechtfertigt20. In Fällen, in denen der Nachweis einer laufenden Virusentwicklung möglich ist, dient dies jedoch als eindeutiger Indikator für die Existenz eines infektiösen Virus. In unserem Fall stellten wir in einem Einzelzimmer eine Umweltverschmutzung fest und der Patient wurde in einen Isolationsraum mit Unterdruck und hohem Luftwechsel für Infektionskrankheiten verlegt.

Die klinische Wirksamkeit von Rekonvaleszenzplasma bei Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung wurde nicht nachgewiesen21, und seine Verwendung in verschiedenen Infektions- und Krankheitsstadien bleibt experimentell; Daher schlagen wir vor, dass es der Verwendung im Rahmen klinischer Studien und unter strenger Überwachung klinischer und virologischer Parameter vorbehalten bleiben sollte. Die Daten dieses einzelnen Patienten weisen darauf hin, dass bei der Rekonvaleszenz-Plasmatherapie bei Patienten mit Immunsuppression sowohl der T-Zellen- als auch der B-Zellen-Arme Vorsicht geboten ist; Bei diesen Patienten erhalten die verabreichten Antikörper kaum Unterstützung durch zytotoxische T-Zellen, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Clearance verringert und theoretisch das Potenzial für die Entwicklung von Escape-Mutationen bei SARS-CoV-2 erhöht wird. Obwohl wir auf weitere Daten warten, sollte in Fällen, in denen die Aufnahme in klinische Studien nicht möglich ist, die Verabreichung von Rekonvaleszenzplasma für klinische Zwecke an immunsupprimierte Personen idealerweise nur als Teil von Beobachtungsstudien in Betracht gezogen werden, die vorzugsweise in Einzelzimmern mit verbesserten Vorsichtsmaßnahmen zur Infektionskontrolle durchgeführt werden , einschließlich Umweltprobenahme von SARS-CoV-2 und Echtzeitsequenzierung. Das Verständnis der Virusdynamik und die Charakterisierung der Virusentwicklung als Reaktion auf unterschiedliche Selektionsdrücke bei einem immungeschwächten Individuum sind nicht nur für eine verbesserte Patientenversorgung, sondern auch zum Nutzen der öffentlichen Gesundheit notwendig.

Dem Patienten wurden in regelmäßigen Abständen Serienproben aus den unteren Atemwegen (Sputum oder endotracheales Aspirat), den oberen Atemwegen (Rachen- und Nasenabstrich) und aus dem Stuhl entnommen. Die Nukleinsäureextraktion erfolgte aus 500 μl Probe mit einer Verdünnung des MS2-Bakteriophagen als interne Kontrolle unter Verwendung der easyMAG-Plattform (Biomerieux) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alle Proben wurden mit einem validierten einstufigen RT-qPCR-Assay, der in Zusammenarbeit mit Public Health England Clinical Microbiology22 entwickelt wurde, auf das Vorhandensein von SARS-CoV-2 getestet. Alle Amplifikationsreaktionen wurden auf einem Rotorgene PCR-Gerät durchgeführt. Als positiv galten Proben mit einem Ct-Wert von ≤36.

Seren von genesenen Patienten in der COVIDx-Studie23 wurden zum Testen der Neutralisierungsaktivität durch SARS-CoV-2-Mutanten verwendet.

Rekombinante SARS-CoV-2-Nukleokapsid-, Spike- und RBD-Proteine ​​wurden kovalent an verschiedene carboxylierte Bead-Sets (Luminex) gekoppelt, um einen Triplex zu bilden, und wie zuvor beschrieben analysiert24. Die spezifische Bindung wurde als mittlere Fluoreszenzintensität angegeben.

Vollblut wurde 1:5 in RPMI in F-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning) verdünnt und durch einzelne Stimulation mit Phytohämagglutinin (10 μg ml–1; Sigma-Aldrich), Lipopolysaccharid (1 μg ml–1, List Biochemicals) oder aktiviert Kostimulation mit Anti-CD3- (MEM57, Abcam, 200 ng ml-1, 1:1.000) und IL-2-Antikörpern (Immunotools, 1.430 U ml-1, 1:1.000). Überstände wurden nach 24 Stunden entnommen. Die Werte (pg ml−1) werden für IFNγ, IL-17, IL-2, TNF, IL-6, IL-1b und IL-10 angezeigt. Zytokine wurden durch multiplexierte partikelbasierte Durchflusszytometrie auf einem Luminex-Analysegerät (Bio-Plex, Bio-Rad) unter Verwendung eines kundenspezifischen Kits von R&D Systems (R&D Systems) gemessen.

Für die virale Genomsequenzierung wurde die Gesamt-RNA wie zuvor beschrieben aus den Proben extrahiert25. Die Proben wurden mit MinION-Durchflusszellen v.9.4.1 (Oxford Nanopore Technologies) nach dem ARTICnetwork v.3-Protokoll26 und BAM-Dateien, die mit der ARTICnetwork-Assembly-Pipeline27 zusammengestellt wurden, sequenziert. Ein repräsentativer Satz von 10 Sequenzen wurde ausgewählt und ebenfalls mithilfe der Illumina MiSeq-Plattform sequenziert. Die Amplikons wurden auf 2 ng μl-1 verdünnt und 25 μl (50 ng) wurden als Input für jede Bibliotheksvorbereitungsreaktion verwendet. Für die Bibliotheksvorbereitung wurde das KAPA Hyper Prep Kit (Roche) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, die Amplifikate wurden am Ende repariert und mit einem A-Überhang versehen; diese wurden dann mit 15 mM NEXTflex DNA Barcodes (Bio Scientific) ligiert. Postligationsprodukte wurden mit AMPure-Perlen gereinigt und in 25 μl eluiert. Anschließend wurden 20 μl für die Bibliotheksamplifikation durch 5 PCR-Zyklen verwendet. Für die Negativkontrollen wurde 1 ng für die ligationsbasierte Bibliotheksvorbereitung verwendet. Alle Bibliotheken wurden mit TapeStation (Agilent Technologies) untersucht, um die Fragmentgröße zu bestimmen, und durch qPCR quantifiziert. Alle Bibliotheken wurden dann entsprechend in äquimolaren Verhältnissen gepoolt. Die Bibliotheken wurden mit 15 nM geladen und mit 5 % PhiX (Illumina) versetzt und für den MiSeq 500-Zyklus unter Verwendung eines Miseq Nano v.2 mit 2 × 250 bp Paired-End-Sequenzierung weiter sequenziert. Für einen Variantenaufruf waren mindestens zehn Lesevorgänge erforderlich.

Für die Long-Read-Sequenzierung wurden Genome mit referenzbasierter Assemblierung und einer kuratierten Bioinformatik-Pipeline mit einer 20-fachen Mindestabdeckung über das gesamte Genom zusammengestellt27. Für die Short-Read-Sequenzierung wurden FASTQ-Dateien heruntergeladen, Lesevorgänge mit schlechter Qualität identifiziert und entfernt und sowohl Illumina- als auch PHiX-Adapter wurden mit TrimGalore v.0.6.628 entfernt. Getrimmte Paired-End-Reads wurden mithilfe von MiniMap2-2.17 mit den Argumenten -ax und sr29 der SARS-CoV-2-Referenzsequenz MN908947.3 des National Center for Biotechnology Information zugeordnet. BAM-Dateien wurden dann mit Samtools v.1.11 sortiert und indiziert und optische PCR-Duplikate wurden mit Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) entfernt. Konsenssequenzen von Nukleinsäuren mit einer Gesamtgenomabdeckung von mindestens 20x wurden mit BCFtools unter Verwendung einer Mehrheitsschwelle von 0 % generiert.

Variantenhäufigkeiten wurden mithilfe von benutzerdefiniertem Code als Teil des AnCovMulti-Pakets (https://github.com/PollockLaboratory/AnCovMulti) validiert. Die Hauptidee dieser Validierung bestand darin, konsistente potenzielle Verstärkungsfehler und Veränderlichkeit gegen Ende der Illumina-Messungen zu identifizieren und zu beseitigen. Darüber hinaus wurde eine strenge Filterung angewendet, um eine voreingenommene Amplifikation früher, im Labor induzierter Mutationen oder sehr geringer Kopienvariationen zu entfernen.

Die Filterung bestand aus der Anforderung einer exakten Initiierung an einem Primer innerhalb von 2 bp vor Beginn eines Lesevorgangs, einer Leselänge von mindestens 247 bp, weniger als vier gut getrennten Stellen, die von der Referenzsequenz abweichen, einer maximalen Insertionsgröße von drei Nukleotiden, einem Maximum Deletionsgröße von 11 bp und Auflösung widersprüchlicher Signale von verschiedenen Primern.

Virale RNA-Extrakte wurden aus jeder Probe revers transkribiert, um die Diversität der Viruspopulation ausreichend zu erfassen, ohne dass ein Resampling-Bias entsteht. Für die reverse Transkription wurden SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific) und genspezifische Primer verwendet. Template-RNA wurde mit RNase H (Thermo Fisher Scientific) abgebaut. Bei allen verwendeten Primern handelte es sich um „interne“ Primer, die mithilfe des Mehrfachsequenz-Alignments der Konsensussequenzen des Patienten entwickelt wurden, das durch Next-Generation-Sequenzierung erhalten wurde. Eine Teilgensequenz von Spike (kodiert für die Aminosäuren 21–800) wurde durch verschachtelte PCR als eine zusammenhängende DNA-Länge amplifiziert (das Spike-Gen ist etwa 1,8 kb groß). Endverdünnte cDNA wurde durch PCR unter Verwendung von Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) amplifiziert, sodass 30 % der Reaktionen positiv waren30. Laut Poisson-Statistik wurde davon ausgegangen, dass die Wahrscheinlichkeit, dass Sequenzen von HIV-1-Einzelgenomen stammen, bei ≥80 % liegt. Wir haben zu jedem Probenzeitpunkt zwischen 20 und 60 einzelne Genome erhalten, um eine 90-prozentige Sicherheit bei der Erkennung von Varianten zu erreichen, die in vivo bei ≥8 % der Viruspopulation vorhanden sind31,32. Partielle Spike-Amplikons, die durch PCR-Amplifikation mit terminaler Verdünnung erhalten wurden, wurden Sanger-sequenziert, um unter Verwendung eines weiteren Satzes von acht hauseigenen Primern eine zusammenhängende Sequenz zu bilden. Die Sanger-Sequenzierung wurde von Genewiz bereitgestellt und die manuelle Sequenzbearbeitung wurde mit der DNA Dynamo-Software (Blue Tractor Software) durchgeführt.

Alle verfügbaren Vollgenom-SARS-CoV-2-Sequenzen wurden am 16. Dezember 2020 aus der GISAID-Datenbank (http://gisaid.org/)33 heruntergeladen. Doppelte und minderwertige Sequenzen (>5 % Nukleokapsidregionen) wurden entfernt ein Datensatz von 212.297 Sequenzen mit einer Länge von mehr als 29.000 bp. Alle Sequenzen wurden nach Namen sortiert und nur Sequenzen mit britischen/englischen Kennungen wurden beibehalten. Aus diesem Datensatz wurden Sequenzen dedupliziert und in Abbildungen, in denen Hintergrundsequenzen erforderlich waren, mithilfe von seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) zufällig unterabgetastet. Alle Sequenzen wurden mit MAFFT v.7.475 mit automatischer Geschmacksauswahl34 auf den SARS-CoV-2-Referenzstamm MN908947.3 abgeglichen. Allen Sequenzen wurden wichtige SARS-CoV-2-Clade-Mitgliedschaften zugewiesen, wobei sowohl der Nextclade-Server v.0.9 (https://clades.nextstrain.org/) als auch Phylogenetic Assignment Of Named Global Outbreak Lineages (PANGOLIN)35 verwendet wurden.

Phylogenetische Bäume mit maximaler Wahrscheinlichkeit wurden unter Verwendung des oben kuratierten Datensatzes mit IQ-TREE v.2.1.236 erstellt. Die Auswahl evolutionärer Modelle für Bäume wurde mithilfe von ModelFinder37 abgeleitet und Bäume wurden mithilfe des GTR + F + I-Modells mit 1.000 ultraschnellen Bootstrap-Replikaten38 geschätzt. Alle Bäume wurden mit Figtree v.1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) visualisiert, auf der SARS-CoV-2-Referenzsequenz verwurzelt und die Knoten in absteigender Reihenfolge angeordnet. Knoten mit Bootstraps-Werten von weniger als 50 wurden mithilfe eines internen Skripts reduziert.

Das SAMFIRE-Paket v.1.0639 wurde verwendet, um Allelfrequenztrajektorien aus BAM-Dateidaten abzurufen. Lesevorgänge wurden in diese Analyse einbezogen, wenn sie einen mittleren PHRED-Score von mindestens 30 aufwiesen, wobei die Enden der Lesevorgänge bei Bedarf gekürzt wurden, um dies zu erreichen. Anschließend wurden die Nukleotide gefiltert, um einen PHRED-Wert von mindestens 30 zu erreichen; Lesevorgänge mit weniger als 30 Lesevorgängen wurden verworfen. Abstände zwischen Sequenzen, die niederfrequente Varianteninformationen berücksichtigen, wurden ebenfalls mit SAMFIRE ermittelt. Die in einem früheren Artikel40 beschriebene Sequenzdistanzmetrik kombiniert Allelfrequenzen im gesamten Genom. Wobei L die Länge des Genoms ist, definieren wir q(t) als einen 4 × L-Elementvektor, der die Häufigkeiten jedes der Nukleotide A, C, G und T an jedem Ort im zum Zeitpunkt t beprobten viralen Genom beschreibt. Für jeden gegebenen Ort i im Genom berechnen wir die Änderung der Allelfrequenzen zwischen den Zeitpunkten t1 und t2 über eine Verallgemeinerung der Hamming-Distanz

wobei die vertikalen Linien den absoluten Wert der Differenz angeben. Diese Statistiken wurden dann im gesamten Genom kombiniert, um die paarweise Sequenzabstandsmetrik zu erstellen

Das Mathematica-Softwarepaket wurde verwendet, um eine Regressionsanalyse der paarweisen Sequenzabstände über die Zeit durchzuführen, was zu einer Schätzung der mittleren Rate der Sequenzentwicklung innerhalb des Wirts führte. Im Gegensatz zur phylogenetischen Analyse ging dieser Ansatz davon aus, dass die an den Tagen 93 und 95 gesammelten Proben durch stochastische Emission aus einer räumlich getrennten Subpopulation innerhalb des Wirts entstanden, was zu einer niedrigeren abgeleiteten Rate der Virusentwicklung für den Großteil der Viruspopulation führte.

Alle Varianten wurden unrechtmäßig mit benutzerdefiniertem Code als Teil des AnCovMulti-Pakets (https://github.com/PollockLaboratory/AnCovMulti) validiert.

Die Zellen wurden mit den angegebenen Plasmidpräparaten transfiziert und 48 Stunden nach der Transfektion wurde der Kulturüberstand gesammelt und durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm geleitet, um Zelltrümmer zu entfernen. Das Filtrat wurde 120 Minuten lang bei 15.000 U/min zentrifugiert, um Virionen zu pelletieren. Die pelletierten Virionen wurden in Laemmli-Reduktionspuffer (1 M Tris-HCl (pH 6,8), SDS, 100 % Glycerin, β-Mercaptoethanol und Bromphenolblau) lysiert. Pelletierte Virionen wurden einer Elektrophorese auf SDS 4–12 % Bis-Tris-Proteingelen (Thermo Fisher Scientific) unter reduzierenden Bedingungen unterzogen. Anschließend erfolgte ein Elektroblotting auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen. Die SARS-CoV-2-Spike-Proteine ​​wurden mithilfe eines ChemiDoc MP-Bildgebungssystems (Biorad) unter Verwendung von Anti-Spike-S2-Antikörpern (Invitrogen; 1:1.000-Verdünnung) und Anti-p24-Gag-Antikörpern (NIH AIDS Reagents; 1:1.000-Verdünnung) sichtbar gemacht.

Alle Sequenzen wurden auf mögliche Rekombination getestet, da dies die evolutionären Schätzungen beeinflussen würde. Mögliche Rekombinationsereignisse wurden mit neun Algorithmen (RDP, MaxChi, SisScan, GeneConv, Bootscan, PhylPro, Chimera, LARD und 3SEQ) untersucht, die in RDP5 mit Standardeinstellungen41 implementiert waren. Um etwaige Ergebnisse zu untermauern, wurde ClonalFrameML v.1.1242 auch verwendet, um Rekombinations-Breakpoints abzuleiten. Keines der Programme fand in unseren Daten Hinweise auf eine Rekombination.

Das PyMOL Molecular Graphics System v.2.4.0 (https://github.com/schrodinger/pymol-open-source/releases) wurde verwendet, um den Standort der vier Spike-Mutationen von Interesse auf einem zuvor veröffentlichten SARS-CoV-Virus abzubilden. 2-Spike-Struktur (PDB: 6ZGE)43.

Der zur Untersuchung von Rekonvaleszenzplasma auf Antikörpertiter verwendete Anti-SARS-CoV-2-ELISA (IgG)-Test war Euroimmun Medizinische Labordiagnostika. Dieser indirekte ELISA-basierte Assay verwendet ein rekombinantes Struktur-Spike-1-Protein (S1) von SARS-CoV-2, das in der menschlichen Zelllinie HEK293 exprimiert wird, zum Nachweis von SARS-CoV-2-IgG.

Aminosäuresubstitutionen wurden in das D614G pCDNA_SARS-CoV-2_Spike-Plasmid wie zuvor beschrieben44 unter Verwendung des QuikChange Lightening Site-Directed Mutagenesis-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Agilent Technologies) eingeführt.

Virale Vektoren wurden durch Transfektion von HEK293T-Zellen unter Verwendung des Fugene HD-Transfektionsreagenzes (Promega) hergestellt. HEK293T-Zellen wurden mit einer Mischung aus 11 μl Fugene HD, 1 μg pCDNAΔ19Spike-HA, 1 μg p8.91 HIV-1 gag-pol-Expressionsvektor45,46 und 1,5 μg pCSFLW (das das Firefly-Luciferase-Reportergen exprimiert) transfiziert das HIV-1-Verpackungssignal). Der Virusüberstand wurde 48 und 72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch einen 0,45-μm-Filter filtriert und bei –80 °C gelagert. Die 50-prozentige Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) des SARS-CoV-2-Pseudovirus wurde mit dem Steady-Glo-Luciferase-Assaysystem (Promega) bestimmt.

Die Reverse-Transkriptase-Aktivität von Viruspräparaten wurde durch qPCR unter Verwendung eines SYBR-Green-basierten produktverstärkten PCR-Assays wie zuvor beschrieben47 bestimmt. Kurz gesagt, zehnfache Verdünnungen des Virusüberstands wurden im Verhältnis 1:1 in einer 2-fachen Lyselösung (bestehend aus 40 % Glycerin (Vol./Vol.), 0,25 % Triton X-100 (Vol./Vol.) und 100 mM KCl lysiert , RNase-Inhibitor 0,8 U ml−1, Tris HCL 100 mM, gepuffert auf pH 7,4) für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend wurden 12 μl jedes Probenlysats zu 13 μl eines SYBR Green-Mastermixes (enthaltend 0,5 μM MS2-RNA-Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 3,5 pmol ml–1 MS2-RNA und 0,125 U μl–1 Ribolock-RNase-Inhibitor) gegeben Die relativen Mengen an Reverse-Transkriptase-Aktivität wurden als Transkriptionsrate der Bakteriophagen-MS2-RNA bestimmt, wobei die absolute Reverse-Transkriptase-Aktivität durch Vergleich der relativen Mengen an Reverse-Transkriptase mit einem Reverse-Transkriptase-Standard bekannter Aktivität berechnet wurde.

Es wurde gezeigt, dass Spike-Pseudotyp-Assays ähnliche Eigenschaften aufweisen wie Neutralisationstests mit vollständig infektiösem Wildtyp-SARS-CoV-28. Virusneutralisierungstests wurden an HEK293T-Zellen durchgeführt, die vorübergehend mit ACE2 und TMPRSS2 transfiziert wurden, unter Verwendung eines pseudotypisierten SARS-CoV-2-Spike-Virus, der Luciferase exprimiert48. Das pseudotypisierte Virus wurde mit Reihenverdünnungen von hitzeinaktivierten Humanserumproben oder Rekonvaleszenzplasma im Duplikat 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Es wurden auch reine Virus- und Zellkontrollen einbezogen. Anschließend wurden jeder Vertiefung frisch trypsinisierte HEK293T ACE2- und TMPRSS2-exprimierende Zellen zugesetzt. Nach 48-stündiger Inkubation in einer Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 °C wurde die Lumineszenz mit dem Steady-Glo-Luciferase-Assaysystem (Promega) gemessen.

Virusneutralisierungstests wurden unter Verwendung von HeLa-Zellen, die ACE2 stabil exprimieren, und unter Verwendung eines pseudotypisierten SARS-CoV-2-Spike-Virus, der Luciferase exprimiert, wie zuvor beschrieben49, durchgeführt. Pseudotypisiertes Virus wurde mit Reihenverdünnungen gereinigter monoklonaler Antikörper9 im Duplikat 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden jeder Vertiefung frisch trypsinisierte HeLa ACE2-exprimierende Zellen zugesetzt. Nach 48-stündiger Inkubation in einer Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 °C wurde die Lumineszenz mit einem Bright-Glo-Luciferase-Assaysystem (Promega) gemessen und die Neutralisierung im Vergleich zu reinen Viruskontrollen berechnet. IC50-Werte wurden in GraphPad Prism berechnet.

Die Studie wurde vom East of England-Cambridge Central Research Ethics Committee (17/EE/0025) genehmigt. Sowohl vom Patienten als auch von seiner Familie wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Weitere Kontrollpatienten mit COVID-19 wurden mit Genehmigung des Ethikprüfungsausschusses (17/EE/0025) in das NIHR BioResource Centre Cambridge aufgenommen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Lang gelesene Sequenzierungsdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden in der NCBI SRA-Datenbank mit den Zugangscodes SAMN16976824–SAMN16976846 unter BioProject PRJNA682013 hinterlegt. Kurze Lesevorgänge und Daten zur Erstellung von Zahlen wurden unter https://github.com/Steven-Kemp/sequence_files hinterlegt. Alle Daten sind auch beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Zum Filtern und Aufrufen von Varianten aus den Illumina-Daten wurde das SAMFIRE-Paket v.1.06 verwendet. Es ist unter https://github.com/cjri/samfire/ zur Überprüfung verfügbar. Zur Validierung der Variantenhäufigkeiten wurde zusätzlicher Code verwendet, der unter https://github.com/PollockLaboratory/AnCovMulti zu finden ist.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05104-2

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Wir danken dem Patienten und seiner Familie. Wir danken den Mitarbeitern der CUH und der NIHR Cambridge Clinical Research Facility; R. Kugathasan und W. Barclay für Diskussionen; M. Curran, W. Hamilton und D. Sparkes, A. Floto und F. Gallagher; J. Voss für die Schenkung von HeLa-Zellen, die ACE2 stabil exprimieren; und J. Nathan für das RBD-Protein und L. James für das Nukleokapsid-Protein. COG-UK wird durch Mittel des Medical Research Council (MRC), Teil von UK Research & Innovation (UKRI), des National Institute of Health Research (NIHR) und von Genome Research Limited, firmierend als Wellcome Sanger Institute, unterstützt. RKG wird durch ein Wellcome Trust Senior Fellowship in Clinical Science (WT108082AIA) unterstützt. LEM wird durch einen Medical Research Council Career Development Award (MR/R008698/1) unterstützt. SAK wird von der Bill and Melinda Gates Foundation über den PANGEA-Zuschuss (OPP1175094) unterstützt. DAC wird durch ein Wellcome Trust Clinical PhD Research Fellowship unterstützt. CJRI dankt MRC-Finanzierung (MC_UU_00002/11). Diese Forschung wurde vom National Institute for Health Research (NIHR), dem Cambridge Biomedical Research Centre, der Cambridge Clinical Trials Unit (CCTU) und vom UCL Coronavirus Response Fund unterstützt und durch großzügige Spenden von UCL-Unterstützern, Alumni und Freunden (bis) ermöglicht LEM). JAGB wird vom Medical Research Council (MC_UP_1201/16) unterstützt. IGG ist Wellcome Senior Fellow und wird vom Wellcome Trust (207498/Z/17/Z) unterstützt. DDP wird von NIH GM083127 unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Steven A. Kemp, Dami A. Collier, Rawlings P. Datir

Abteilung für Infektion und Immunität, University College London, London, Großbritannien

Steven A. Kemp, Dami A. Collier, Chloe Rees-Spear, Richard A. Goldstein und Laura E. McCoy

Cambridge Institute of Therapeutic Immunology & Infectious Disease (CITIID), Cambridge, Großbritannien

Dami A. Collier, Rawlings P. Datir, Isabella ATM Ferreira, Petra Mlcochova, Anita Chandra, Stephen Baker, Gordon Dougan, Christoph Hess, Paul J. Lehner, Paul A. Lyons, Nicholas J. Matheson, James ED Thaventhiran, Michael P .Weekes, Ben Bullman, Kelvin Hunter, Federica Mescia, Nicole Pond, Laura Bergamaschi, Ariana Betancourt, Georgie Bower, Chiara Cossetti, Madeline Epping, Andrew Hinch, Veronica Romashova, Lori Turner, Yorgo Modis, Kendra E. Leigh, Kenneth GC Smith & Ravindra K. Gupta

Medizinische Fakultät, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Dami A. Collier, Rawlings P. Datir, Isabella ATM Ferreira, Petra Mlcochova, Anita Chandra, Stephen Baker, Gordon Dougan, Christoph Hess, Paul J. Lehner, Paul A. Lyons, Nicholas J. Matheson, Charlotte Summers, James ED Thaventhiran , Mark Toshner, Benjamin J. Dunmore, Stefan Gräf, Josh Hodgson, Christopher Huang, Kelvin Hunter, Ekaterina Legchenko, Cecilia Matara, Jennifer Martin, Federica Mescia, Ciara O'Donnell, Linda Pointon, Nicole Pond, Joy Shih, Rachel Sutcliffe, Tobias Tilly, Carmen Treacy, Zhen Tong, Jennifer Wood, Laura Bergamaschi, Ariana Betancourt, Georgie Bower, Chiara Cossetti, Aloka De Sa, Madeline Epping, Andrew Hinch, Sarah Jackson, Isobel Jarvis, Daniel Lewis, Joe Marsden, Georgina Okecha, Ommar Omarjee, Marianne Perera, Nathan Richoz, Veronika Romashova, Natalia Savinykh Yarkoni, Rahul Sharma, Lori Turner, Eckart MDD De Bie, Katherine Bunclark, Michael Mackay, Mayurun Selvan, M. Estee Torok, Elizabeth Blane, Yorgo Modis, Kendra E. Leigh , Kenneth GC Smith, John R. Bradley und Ravindra K. Gupta

Abteilung für Infektionskrankheiten, Cambridge University NHS Hospitals Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

Salma Gayed, Katherine Sharrocks, Jordan P. Skittrall, Theodore Gouliouris und Effrossyni Gkrania-Klotsas

Abteilung für Pathologie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Aminu Jahun, Myra Hosmillo, Anna Smielewska und Ian G. Goodfellow

NHS Blood and Transplant, Oxford und BRC-Thema Hämatologie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Ines Ushiro Lumb & David J. Roberts

Abteilung für virale Pseudotypen, Medway School of Pharmacy, University of Kent, Canterbury, Großbritannien

Nigel Temperton

Labor für Molekularbiologie des Medical Research Council, Cambridge, Großbritannien

George Modis, Kendra E. Leigh und John AG Briggs

Abteilung für Medizinische Mikrobiologie, Akademisches Medizinisches Zentrum, Universität Amsterdam, Amsterdam, Niederlande

Marit J. van Gils

NIHR Cambridge Bioresource, Cambridge, Großbritannien

John R. Bradley

Abteilung für Virologie, Cambridge University NHS Hospitals Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

Chris Smith & Anna Smielewska

Abteilung für klinische Biochemie und Immunologie, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Großbritannien

Rainer Doffinger, Lourdes Ceron-Gutierrez & Gabriela Barcenas-Morales

FES-Cuautitlán, UNAM, Cuautitlán Izcalli, Mexiko

Gabriela Barcenas-Morales

Biochemie und Molekulargenetik, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO, USA

Sarah Spencer und David D. Pollock

Abteilung für Angewandte Mathematik und Theoretische Physik, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Nathalie Kingston, Stefan Gräf, John Allison, Helen Butcher, Daniela Caputo, Debbie Clapham-Riley, Eleanor Dewhurst, Anita Furlong, Barbara Graves, Jennifer Gray, Tasmin Ivers, Mary Kasanicki, Emma Le Gresley, Rachel Linger, Sarah Meloy, Francesca Muldoon , Nigel Ovington, Sofia Papadia, Isabel Phelan, Hannah Stark, Kathleen E. Stirrups, Paul Townsend, Neil Walker, Jennifer Webster, Jordan P. Skittrall und Christopher JR Illingworth

Labor für klinische Mikrobiologie und öffentliche Gesundheit, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Großbritannien

Jordan P. Shittall

MRC Biostatistics Unit, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Chris Jackson und Christopher JR Illingworth

Africa Health Research Institute, Durban, Südafrika

Ravindra K. Gupta

Abteilung für Biomedizin, Universität und Universitätsspital Basel, Basel, Schweiz

Christoph Heß

Botnar Research Center for Child Health (BRCCH) Universität Basel & ETH Zürich, Basel, Schweiz

Christoph Heß

Abteilung für Hämatologie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Nathalie Kingston, Willem H. Owehand, Stefan Gräf, Nick Gleadall, Luca Stefanucci, Jonathan Stephens, John Allison, Nigel Ovington, Kathleen E. Stirrups, Paul Townsend und Neil Walker

Cambridge Clinical Research Centre, NIHR Clinical Research Facility, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Großbritannien

Caroline Saunders, Charlotte Summers, Ashlea Bucke, Jo Calder, Laura Canna, Jason Domingo, Anne Elmer, Stewart Fuller, Sarah Hewitt, Jane Kennet, Sherly Jose, Jenny Kourampa, Anne Meadows, Jane Price, Cherry Publico, Rebecca Rastall, Carla Ribeiro , Jane Rowlands, Valentina Ruffolo, Hugo Tordesillas, Petra Polgarova, Giovanni di Stefano und Mary Kasanicki

Herz- und Lungenforschungsinstitut, Cambridge, Großbritannien

Charlotte Summers & Mark Toshner

Royal Papworth Hospital NHS Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

Charlotte Summers, Mark Toshner, Ali Ansaripour, Alice Michael, Lucy Mwaura, Caroline Patterson und Gary Polwarth

MRC Toxicology Unit, School of Biological Sciences, University of Cambridge, Cambridge, Großbritannien

James ED Thaventhiran

Abteilung für Pädiatrie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Julie Harris & Criona O'Brien

Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, Großbritannien

Stuart Fawke

Abteilung für Veterinärmedizin, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Emma Jones

Abteilung für Biochemie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Marta Wylot

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Rosie Entbindungsklinik, Cambridge, Großbritannien

Stuart Fawke & Oisin Huhn

Cancer Research UK, Cambridge Institute, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Richard Grenfell und Mateusz Strezlecki

Labor für molekulare Krebsdiagnostik, Abteilung für Onkologie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Nette Francesca

Metabolic Research Laboratories, Wellcome Trust-Medical Research Council Institute of Metabolic Science, University of Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Masa Josipovic

Abteilung für Chirurgie, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, Großbritannien

Sabrina Rossi & Cissy Yong

Cambridge and Peterborough Foundation Trust, Fulbourn Hospital, Fulbourn, Cambridge, Großbritannien

Codie Fahey & Rachel Michel

Australian National Phenome Centre, Murdoch University, Murdoch, Westaustralien, Australien

Se-How Bong

Zentrum für Molekulare Medizin und innovative Therapeutika, Health Futures Institute, Murdoch University, Perth, Westaustralien, Australien

Jerome D. Coudert

Zentrum für Computer- und Systemmedizin, Health Futures Institute, Murdoch University, Perth, Westaustralien, Australien

Elaine Holmes

Abteilung für öffentliche Gesundheit und Grundversorgung, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Helen Butcher, Daniela Caputo, Debbie Clapham-Riley, Eleanor Dewhurst, Anita Furlong, Barbara Graves, Jennifer Gray, Tasmin Ivers, Emma Le Gresley, Rachel Linger, Sarah Meloy, Francesca Muldoon, Sofia Papadia, Isabel Phelan, Hannah Stark und Jennifer Webster

Zentrum für Enzyminnovation, University of Portsmouth (PORT), Portsmouth, Großbritannien

Samuel C. Robson und Angela H. Beckett

Institut für Mikrobiologie und Infektion, Universität Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Nicholas J. Loman, Sam Nicholls, Claire McMurray, Alan McNally, Joshua Quick, Radoslaw Poplawski, Joanne Stockton und Will Rowe

Medizinische Fakultät, Universität Cardiff, Cardiff, Großbritannien

Thomas R. Connor, Anna Price, Joel Southgate, Christine Kitchen, Huw Gulliver, Ian Merrick, Martyn Guest, Robert Munn, Angela Marchbank, Trudy Workman, William Fuller und Catherine Bresner

Public Health Wales NHS Trust, Cardiff, Großbritannien

Thomas R. Connor, Sally Corden, Catherine Moore, Joanne Watkins, Matthew Bull, Nicole Pacchiarini, Simon Cottrell, Sara Rey, David Heyburn, Chris Williams, Malorie Perry, Noel Craine, Alec Birchley, Alexander Adams, Amy Plimmer, Bree Gatica- Wilcox, Caoimhe McKerr, Ember Hilvers, Hannah Jones, Hibo Asad, Jason Coombes, Johnathan M. Evans, Laia Fina, Lauren Gilbert, Lee Graham, Michelle Cronin, Sara Kumziene-Summerhayes, Sarah Taylor, Sophie Jones, Joel Southgate, Giri Shankar , Rachel Jones, Robin Howe, Alisha Davies, Elen De Lacy, Fatima Downing, Sue Edwards, Laura Gifford, Mari Morgan und Amy Gaskin

Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Tanya Golubchik, David Bonsall und Christophe Fraser

Abteilung für Virologie, King's College London, London, Großbritannien

Rocio T. Martinez Nunez & Themoula Charalampous

Medizinische Fakultät, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Catherine Ludden, Ewan M. Harrison, Dinesh Aggarwal, Alessandro M. Carabelli, Michael H. Spencer Chapman, Chris Ruis, Sharon J. Peacock, Beth Blane, Sophia T. Girgis, Katherine L. Bellis, Nazreen F. Hadjirin, Leanne M . Kermack, Michael R. Chapman, Sophie Palmer, Carol M. Churcher, Ellena Brooks, Kim S. Smith, Katerina Galai, Georgina M. McManus, Danielle Leek, Sushmita Sridhar, Sally Forrest, Claire Cormie, Harmeet K. Gill, Joana Dias, Ellen E. Higginson, Mailis Maes, Jamie Young, Elias Allara und Clare Pearson

Abteilung für Pathogengenomik, Wellcome Sanger Institute, London, Großbritannien

Ian Johnston, David K. Jackson, Ewan M. Harrison, Sonia Goncalves, Rich Livett, Roberto Amato, Jeff Barrett, Dinesh Aggarwal, Cordelia F. Langford, John Sillitoe, Dominic Kwiatkowski, Mara Lawniczak, Alex Alderton, Inigo Martincorena, Andrew R . Bassett, Cristina V. Ariani, Michael H. Spencer Chapman, Laura Letchford, Steve Palmer, Danni Weldon, Naomi R. Park, Karen Oliver, Steven Leonard, Jillian Durham, Robert Davies, Mathew A. Beale, Katherine L. Bellis, Matthew J. Dorman, Eleanor Drury, Leanne Kane, Sally Kay, Samantha McGuigan, Rachel Nelson, Liam Prestwood, Shavanthi Rajatileka, Robin J. Moll, Marina Gourtovaia, Gerry Tonkin-Hill, Kevin Lewis, Jaime M. Tovar-Corona, Keith James, Jon-Paul Keatley, John Danesh, Michael R. Chapman, Charlotte Beaver, Luke Foulser, Sushmita Sridhar, Dorota Jamrozy, Stephanie Lo, Minal Patel, Emma Betteridge, Ben W. Farr, Scott Goodwin, Michael A. Quail, Carol Scott, Lesley Shirley, Scott AJ Thurston, Diana Rajan, Iraad F. Bronner, Louise Aigrain, Nicholas M. Redshaw, Stefanie V. Lensing, Shane McCarthy, Alex Makunin, James Bonfield, Christoph Puethe, Andrew Whitwham und Jennifier Liddle

Medizinische Fakultät, Universität Brighton, Brighton, Großbritannien

Colin P. Smith, Giselda Bucca und Andrew R. Hesketh

Genomics Innovation Department, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, London, Großbritannien

Ali R. Awan und Chloe L. Fisher

Abteilung für Infektionskrankheiten, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

M. Estee Torok & William L. Hamilton

Abteilung für Mikrobiologie, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

M. Estee Torok & William L. Hamilton

Abteilung für Medizin, University Hospital Southampton NHS Foundation Trust, Southampton, Großbritannien

Kordo Saeed, Jacqui A. Prieto, Siona Silveira, Emanuela Pelosi, Eleri Wilson-Davies, Adhyana IK Mahanama, Buddhini Samaraweera und Sarah Jeremiah

Medizinische Fakultät, School of Medicine, University of Southampton, Southampton, Großbritannien

Kordo Saeed

Fachbereich Medizin, School of Health Sciences, University of Southampton, Southampton, Großbritannien

Jacqui A. Prieto

Abteilung für klinische Infektions- und Diagnostikforschung, St. Thomas' Hospital und Kings College London, London, Großbritannien

Luke B. Snell und Amita Patel

Belfast Health & Social Care Trust, Belfast, Großbritannien

Derek J. Fairley, James P. McKenna und Tanya Curran

Medizinische Fakultät, Queen's University Belfast, Belfast, Großbritannien

Derek J. Fairley, David A. Simpson, Declan T. Bradley, Zoltan Molnar, Thomas Thompson und Erwan Acheson

Deep Seq Department, School of Life Sciences, Queens Medical Centre, University of Nottingham, Nottingham, Großbritannien

Matthew W. Loose, Nadine Holmes, Christopher Moore, Matthew Carlile, Victoria Wright, Fei Sang und Johnny Debebe

NHS Foundation Trust der East Kent Hospitals University, Canterbury, Großbritannien

Samuel Moses & Hannah Lowe

Medizinische Fakultät, University of Kent, Canterbury, Großbritannien

Samuel Moses

Zentrum für Biotechnologie in der gebauten Umwelt, Northumbria University, Newcastle upon Tyne, Großbritannien

Darren L. Smith, Matthew Bashton und Gregory R. Young

Medizinische Fakultät, Northumbria University, Newcastle upon Tyne, Großbritannien

Darren L. Smith, Matthew Bashton, Andrew Nelson, Gregory R. Young, Clare M. McCann und Wen C. Yew

NU-OMICS, Northumbria University, Newcastle upon Tyne, Großbritannien

Darren L. Smith, Andrew Nelson und Clare M. McCann

Zentrum für genomische Pathogenüberwachung, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

David M. Aanensen, Anthony P. Underwood, Corin A. Yeats, Khalil Abudahab, Ben EW Taylor und Mirko Menegazzo

Labor für klinische Mikrobiologie und öffentliche Gesundheit, Public Health England, Cambridge, Großbritannien

Martin D. Curran & Surendra Parmar

Public Health England, London, Großbritannien

Dinesh Aggarwal, Husam Osman, Meera Chand, Sharon J. Peacock, Esther Robinson, Peter Muir, Ian B. Vipond, Andrew Bosworth, Hannah M. Pymont, Stephanie Hutchings, Alicia Thornton, Richard Myers, Ian Harrison, Chloe Bishop, Vicki Chalker , Richard Hopes, Nicholas W. Machin, Shazaad SY Ahmad, Angie Lackenby, Tamyo Mbisa, Steven Platt, Shahjahan Miah, David Bibby, Carmen Manso, Jonathan Hubb, Gavin Dabrera, Mary Ramsay, Daniel Bradshaw, Ulf Schaefer, Natalie Groves, Eileen Gallagher, David Lee, David Williams, Nicholas Ellaby, Hassan Hartman, Nikos Manesis, Vineet Patel, Juan Ledesma, Katherine A. Twohig, Elias Allara und Clare Pearson

MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, Glasgow, Großbritannien

James G. Shepherd, Emma C. Thomson, David L. Robertson, Kathy K. Li, Rajiv N. Shah, Natasha G. Jesudason, Ana da Silva Filipe, Igor Starinskij, Richard J. Orton, Joseph Hughes, Sreenu Vattipally, Joshua B. Singer, Patawee Asamaphan, Marc O. Niebel, Lily Tong, Alice Broos, Daniel Mair, Jenna Nichols, Stephen N. Carmichael, Kyriaki Nomikou, Elihu Aranday-Cortes, Natasha Johnson und Seema Nickbakhsh

Universität Sheffield, Sheffield, Großbritannien

Matthew D. Parker, Because I. de Silva, Dennis Wang, Matthew Wyles, Danielle C. Groves, Peijun Zhang, Marta Gallis, Stavroula F. Louka, Benjamin B. Lindsey, Timothy M. Freeman, Nikki Smith, Alexander J. Keeley , David G. Partridge, Mohammad Raza, Cariad Evans, Kate Johnson, Adrienn Angyal, Luke R. Green, Paul J. Parsons, Rachel M. Tucker, Rebecca Brown und Max Whiteley

Portsmouth Hospitals University NHS Trust, Portsmouth, Großbritannien

Sharon Glaysher, Anoop J. Chauhan, Scott Elliott, Kelly Bicknell, Sarah Wyllie, Allyson Lloyd und Robert Impey

School of Pharmacy and Biomedical Sciences, University of Portsmouth (PORT), Portsmouth, Großbritannien

Katie F. Loveson, Salman Goudarzi, Christopher Fearn, Kate Cook, Hannah Dent und Hannah Paul

NHS Lothian, Edinburgh, Großbritannien

Kate E. Templeton, Martin P. McHugh, Rebecca Dewar und Elizabeth Wastenge

Universität Edinburgh, Edinburgh, Großbritannien

Kate E. Templeton, Andrew Rambaut, Stefan Rooke, Áine O'Toole, Thomas Williams, Verity Hill, Carlos E. Balcazar, Michael D. Gallagher, Kathleen A. Williamson und Thomas D. Stanton

Medizinische Fakultät, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Dominic Kwiatkowski

Quadram Institute Bioscience, Norwich, Großbritannien

Justin O'Grady, Andrew J. Page, Gemma L. Kay, Nabil-Fareed Alikhan, Alexander J. Trotter, Leonardo de Oliveira Martins, Alison E. Mather, Lizzie Meadows, David J. Baker, Steven Rudder, Alp Aydin und Thanh Le-Viet

Medizinische Fakultät, University of East Anglia, Norwich, Großbritannien

Justin O'Grady und Rose K. Davidson

Public Health Scotland, Glasgow, Großbritannien

Matthew TG Holden, Sharif Shaaban und Seema Nickbakhsh

Heartlands Hospital, Birmingham, Großbritannien

Husam Osman, Esther Robinson, Andrew Bosworth und Li Xu-McCrae

Abteilung für Medizin, Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, Großbritannien

Monique Andersson, Anita Justice, Timothy Peto, David Eyre und Derrick Crook

Abteilung für Medizin, Brighton and Sussex University Hospitals NHS Trust, Brighton, Großbritannien

Mohammed O. Hassan-Ibrahim, Cassandra S. Malone und Benjamin J. Cogger

Medizinische Fakultät, University of Warwick, Warwick, Großbritannien

Chrystala Constantinidou, Meera Unnikrishnan, Richard Stark, Sascha Ott, Laura Baxter, Mohammad T. Alam, Jeffrey KJ Cheng, Hannah E. Bridgewater, Lucy R. Frost, Grace Taylor-Joyce und Paul E. Brown

Medizinische Fakultät, Universität Liverpool, Liverpool, Großbritannien

Alistair C. Darby, Julian A. Hiscox, Steve Paterson, Miren Iturriza-Gomara, Anita O. Lucaci, Sam T. Haldenby, Kathryn A. Jackson, Lance Turtle, Edith E. Vamos, Margaret Hughes, Lucille Rainbow, Richard Eccles, Charlotte Nelson, Mark Whitehead, Richard Gregory, Matthew Gemmell, Claudia Wierzbicki und Hermine J. Webster

Abteilung für Medizin, Imperial College London, London, Großbritannien

Erik M. Volz, Manon Ragonnet-Cronin, Fabricia F. Nascimento, David Jorgensen, Olivia Boyd, Lily Geidelberg, Aileen Rowan, Graham P. Taylor, Igor Siveroni und Rob Johnson

Institut für Zoologie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Oliver G. Pybus, Louis du Plessis, Alex E. Zarebski, Jayna Raghwani, Moritz UG Kraemer, Stephen W. Attwood, Sarah Francois, Tetyana I. Vasylyeva, Navy Staircase Zamudio und Bernardo Gutierrez

Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust, Newcastle, Großbritannien

Yusri Taha, Jennifer Collins, Gary Eltringham, Brendan AI Payne, Shirelle Burton-Fanning und Sheila Waugh

Abteilung für Virologie, Abteilung für Pathologie, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Aminu S. Jahun, Myra Hosmillo, Grant Hall, Yasmin Chaudhry, Malte L. Pinckert und Iliana Georgana

Universitätskliniken Coventry und Warwickshire, Coventry, Großbritannien

Sarojini Pandey, Dimitris Grammatopoulos, Lisa Berry und Katie Jones

Universität Exeter, Exeter, Großbritannien

Ben Temperton, Stephen L. Michell, Aaron R. Jeffries, Jane AH Masoli, Bridget A. Knight, Christopher R. Jones, Claire M. Bewshea, Sian Ellard, Michelle L. Michelsen, Joanna Warwick-Dugdale, Robin Manley, Audrey Farbos , James W. Harrison, Christine M. Sambles und David J. Studholme

University College London, London, Großbritannien

Sunando Roy, Judith Breuer, Rachel J. Williams, Mark Christiansen, Charlotte A. Williams, John A. Hartley, Adam P. Westhorpe, Riaz Janno, Helen L. Lowe, Angeliki Karamani, Leah Ensell, Marius Cotic und Nadua Bayzid

Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Mariateresa de Cesare, John A. Todd, David Buck, Angie Green, Amy Trebes und George MacIntyre-Cockett

Betsi Cadwaladr University Health Board, Betsi Cadwaladr, Großbritannien

Helen Adams

School of Biological Sciences, University of Portsmouth (PORT), Portsmouth, Großbritannien

Yann Bourgeois und Garry P. Scarlett

Warwick Medical School und Institute of Precision Diagnostics, Pathology, UHCW NHS Trust, Warwick, Großbritannien

Dimitris Grammatopoulos

Zentrum für klinische Infektions- und Diagnoseforschung, Abteilung für Infektionskrankheiten, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, London, Großbritannien

Jonathan Edgeworth, Rahul Batra, Themoula Charalampous und Gaia Nebbia

Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, London, Großbritannien

Judith Breuer, Kathryn Ann Harris, Julianne Rose Brown, Nathaniel Storey, Divya Shah, Laura Atkinson und Jack CD Lee

Gesundheitsamt der Cardiff and Vale University, Cardiff, Großbritannien

Michaela John, Sian Morgan, Joshua Maksimovic, Karla Spellman, Kathryn McCluggage, Robert Beer und Safiah Afifi

Schlüsselfertiges Labor, Universität Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Alan McNally, Angus Best, Benita Percival, Jeremy Mirza, Oliver Megram, Megan Mayhew, Liam Crawford, Fiona Ashcroft, Emma Moles-Garcia und Nicola Cumley

Gloucestershire Hospitals NHS Foundation Trust, Gloucester, Großbritannien

John Boyes

Abteilung für Mikrobiologie, Wye Valley NHS Trust, Hereford, Großbritannien

Venkat Sivaprakasam, Fenella Halstead und Wendy Hogsden

Sandwell und West Birmingham NHS Trust, Birmingham, Großbritannien

Tranprit Salluja, Melisa Louise Fenton, Ashok Dadrah und Amanda Symmonds

Norfolk und Norwich University Hospital, Norwich, Großbritannien

Samir Dervisevic, Emma J. Meader, Rachael Stanley und Lindsay Coupland

Royal Devon und Exeter NHS Foundation Trust, Exeter, Großbritannien

Jane AH Masoli, Bridget A. Knight, Christopher R. Jones, Sian Ellard und Cressida Auckland

Barking, Havering und Redbridge University Hospitals NHS Trust, Barking, Großbritannien

Cherian Koshy & Amy Ash

Queen Elizabeth Hospital, Birmingham, Großbritannien

Anna Casey und Liz Ratcliffe

Abteilung für Mikrobiologie, Kettering General Hospital, Kettering, Großbritannien

Thomas Davis, Sahar Eldirdiri und Anita Kenyon

Klinische Mikrobiologie, University Hospitals of Leicester NHS Trust, Leicester, Großbritannien

Christopher Holmes, Paul Bird, Thomas Helmer, Karlie Fallon und Julian Tang

Imperial College Hospitals NHS Trust, London, Großbritannien

Paul Anthony Randell, Alison Cox, Pinglawathee Madona, Alison Holmes, James Price, Siddharth Mookerjee und Frances Bolt

North West London Pathology, London, Großbritannien

Paul Anthony Randell, Alison Cox und Pinglawathee Madonna

Royal Free NHS Trust, London, Großbritannien

Tabitha W. Mahungu, Dianne Irish-Tavares, Tanzina Haque, Jennifer Hart und Eric Witele

South Tees Hospitals NHS Foundation Trust, Newcastle, Großbritannien

Steven Liggett, Paul Baker, Stephen Bonner und Sarah Essex

North Cumbria Integrated Care NHS Foundation Trust, Carlisle, Großbritannien

Clive Graham, Edward Barton, Debra Padgett und Garren Scott

North Tees und Hartlepool NHS Foundation Trust, Stockton-on-Tees, Großbritannien

Emma Swindells und Jane Greenaway

County Durham und Darlington NHS Foundation Trust, Durham, Großbritannien

Sharon Campbell, Veena Raviprakash, Nicola Sheriff, Victoria Blakey und Lesley-Anne Williams

Virologie, School of Life Sciences, Queens Medical Centre, University of Nottingham, Nottingham, Großbritannien

Patrick C. McClure, Joseph G. Chappell, Theocharis Tsoleridis und Jonathan Ball

Abteilung für klinische Mikrobiologie, Queens Medical Centre, Nottingham, Großbritannien

Gemma Clark, Carl Jones, Wendy Smith, Manjinder Khakh, Vicki M. Fleming, Michelle M. Lister, Hannah C. Howson-Wells, Louise Berry, Tim Boswell, Amelia Joseph und Iona Willingham

PathLinks, Northern Lincolnshire & Goole NHS Foundation Trust, Scunthorpe, Großbritannien

Tim J. Sloan, Nichola Duckworth und Sarah Walsh

Basingstoke Hospital, Basingstoke, Großbritannien

Jessica Lynch, Emma Wise, Nathan Moore, Matilde Mori, Nick Cortes und Stephen Kidd

Universität Surrey, Guildford, Großbritannien

Jessica Lynch, Emma Wise, Nathan Moore, Matilde Mori, Nick Cortes und Stephen Kidd

Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Großbritannien

Ben Warne

Swansea University, Swansea, Großbritannien

Ronan A. Lyons

Gesundheitsministerium, Colombo, Sri Lanka

Adhyana IK Mahanama & Buddhini Samaraweera

Cambridge Stem Cell Institute, Universität Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Nicola Reynolds und Michelle Wantoch

Liverpool Clinical Laboratories, Liverpool, Großbritannien

Jenifer Mason, Trevor I. Robinson, Elaine O'Toole, Joanne Watts, Cassie Breen und Angela Cowell

NIHR Health Protection Research Unit in HCAI und AMR, Imperial College London, London, Großbritannien

Alison Holmes, James Price, Siddharth Mookerjee und Frances Bolt

Health Data Research UK Cambridge, Cambridge, Großbritannien

Michael R. Chapman

Hampshire Hospitals NHS Foundation Trust, Winchester, Großbritannien

Gabrielle Vernet & Rebecca Williams

Public Health Agency, London, Großbritannien

Declan T. Bradley und Tim Wyatt

Abteilung für Infektionsbiologie, Fakultät für Infektions- und Tropenkrankheiten, London School of Hygiene & Tropical Medicine, London, Großbritannien

Francis Coll

Universität Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Alex Richter & Andrew Beggs

Westlich von Schottland spezialisiertes Virologiezentrum, NHS Greater Glasgow und Clyde, Glasgow, Großbritannien

Rory N. Gunson

NHS Greater Glasgow und Clyde, Glasgow, Großbritannien

Amanda Bradley, Alasdair Maclean, Guy Mollett und Rachel Blacow

National Infection Service, PHE und Leeds Teaching Hospitals Trust, Leeds, Großbritannien

Antony D. Hale, Louissa R. Macfarlane-Smith, Katherine L. Harper und Holli Carden

Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester, Großbritannien

Nicholas W. Machin, Shazaad SY Ahmad und Ryan P. George

Guy's und St. Thomas' Hospitals, London, Großbritannien

Adela Alcolea-Medina

Viapath, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust und King's College Hospital NHS Foundation Trust, London, Großbritannien

Adela Alcolea-Medina, Alberto C. Cerda, Tammy V. Merrill und Rebekah E. Wilson

Health Services Laboratories, London, Großbritannien

Lisa J. Levett, Judith Heaney, Wendy Chatterton und Monika Pusok

Maidstone und Tunbridge Wells NHS Trust, Maidstone, Großbritannien

Graciela Sluga

Gateshead Health NHS Foundation Trust, Gateshead, Großbritannien

Jonathan Moore und Susanne Stonehouse

Norfolk County Council, Norwich, Großbritannien

Louise Smith

East Suffolk und North Essex NHS Foundation Trust, Ipswich, Großbritannien

Luke Bedford

Medizinische Fakultät, University of Southampton, Southampton, Großbritannien

Matilda Mori

Abteilung für Mikrobiologie, Princess Alexandra Hospital, Harlow, Großbritannien

Nick Levene und Lynn Monaghan

Sheffield Teaching Hospitals, Sheffield, Großbritannien

David G. Partridge, Mohammad Raza, Cariad Evans und Kate Johnson

Institut für Biodiversität, Tiergesundheit und vergleichende Medizin, Glasgow, Großbritannien

Katherine L. Smollett

Abteilung für Infektionskrankheiten, King's College London, London, Großbritannien

Adrian W. Signell, Gilberto Betancor und Harry D. Wilson

Guy's und St. Thomas' BRC, London, Großbritannien

Flavia Flaviani

Newcastle University, Newcastle, Großbritannien

Steven Rushton und Sarah O'Brien

Wellcome Sanger Centre, Hinxton, Großbritannien

Irina Abnizova, Louise Aigrain, Alex Alderton, Mozam Ali, Laura Allen, Roberto Amato, Ralph Anderson, Cristina Ariani, Siobhan Austin-Guest, Sendu Bala, Jeffrey Barrett, Andrew Bassett, Kristina Battleday, James Beal, Mathew Beale, Charlotte Beaver, Sam Bellany, Tristram Bellerby, Katie Bellis, Duncan Berger, Matt Berriman, Emma Betteridge, Paul Bevan, Simon Binley, Jason Bishop, Kirsty Blackburn, James Bonfield, Nick Boughton, Sam Bowker, Timothy Brendler-Spaeth, Iraad Bronner, Tanya Brooklyn, Sarah Kay Buddenborg, Robert Bush, Catarina Caetano, Alex Cagan, Nicola Carter, Joanna Cartwright, Tiago Carvalho Monteiro, Liz Chapman, Tracey-Jane Chillingworth, Peter Clapham, Richard Clark, Adrian Clarke, Catriona Clarke, Daryl Cole, Elizabeth Cook, Maria Coppola, Linda Cornell, Clare Cornwell, Craig Corton, Abby Crackett, Alison Cranage, Harriet Craven, Sarah Craw, Mark Crawford, Tim Cutts, Monika Dabrowska, Matt Davies, Robert Davies, Joseph Dawson, Callum Day, Aiden Densem, Thomas Dibling, Cat Dockree, David Dodd, Sunil Dogga, Matthew Dorman, Gordon Dougan, Martin Dougherty, Alexander Dove, Lucy Drummond, Eleanor Drury, Monika Dudek, Jillian Durham, Laura Durrant, Elizabeth Easthope, Sabine Eckert, Pete Ellis, Ben Farr, Michael Fenton , Marcella Ferrero, Neil Flack, Howerd Fordham, Grace Forsythe, Luke Foulser, Matt Francis, Audrey Fraser, Adam Freeman, Anastasia Galvin, Maria Garcia-Casado, Alex Gedny, Sophia Girgis, James Glover, Sonia Goncalves, Scott Goodwin, Oliver Gould , Marina Gourtovaia, Andy Gray, Emma Gray, Coline Griffiths, Yong Gu, Florence Guerin, Will Hamilton, Hannah Hanks, Ewan Harrison, Alexandria Harrott, Edward Harry, Julia Harvison, Paul Heath, Anastasia Hernandez-Koutoucheva, Rhiannon Hobbs, Dave Holland , Sarah Holmes, Gary Hornett, Nicholas Hough, Liz Huckle, Lena Hughes-Hallet, Adam Hunter, Stephen Inglis, Sameena Iqbal, Adam Jackson, David Jackson, Keith James, Dorota Jamrozy, Carlos Jimenez Verdejo, Ian Johnston, Matthew Jones, Kalyan Kallepally, Leanne Kane, Keely Kay, Sally Kay, Jon Keatley, Alan Keith, Alison King, Lucy Kitchin, Matt Kleanthous, Martina Klimekova, Petra Korlevic, Ksenia Krasheninnkova, Dominic Kwiatkowski, Greg Lane, Cordelia Langford, Adam Laverack, Katharine Law, Mara Lawniczak, Stefanie Lensing, Steven Leonard, Laura Letchford, Kevin Lewis, Amanah Lewis-Wade, Jennifer Liddle, Quan Lin, Sarah Lindsay, Sally Linsdell, Rich Livett, Stephanie Lo, Rhona Long, Jamie Lovell, Jon Lovell, Catherine Ludden, James Mack, Mark Maddison, Aleksei Makunin, Irfan Mamun, Jenny Mansfield, Neil Marriott, Matt Martin, Inigo Martincorena, Matthew Mayho, Shane McCarthy, Jo McClintock, Samantha McGuigan, Sandra McHugh, Liz McMinn, Carl Meadows, Emily Mobley, Robin Moll , Maria Morra, Leanne Morrow, Kathryn Murie, Sian Nash, Claire Nathwani, Plamena Naydenova, Alexandra Neaverson, Rachel Nelson, Ed Nerou, Jon Nicholson, Tabea Nimz, Guillaume G. Noell, Sarah O'Meara, Valeriu Ohan, Karen Oliver, Charles Olney, Doug Ormond, Agnes Oszlanczi, Steve Palmer, Yoke Fei Pang, Barbora Pardubska, Naomi Park, Aaron Parmar, Gaurang Patel, Minal Patel, Maggie Payne, Sharon Peacock, Arabella Petersen, Deborah Plowman, Tom Preston, Liam Prestwood, Christoph Puethe, Michael Quail, Diana Rajan, Shavanthi Rajatileka, Richard Rance, Suzannah Rawlings, Nicholas Redshaw, Joe Reynolds, Mark Reynolds, Simon Rice, Matt Richardson, Connor Roberts, Katrina Robinson, Melanie Robinson, David Robinson, Hazel Rogers, Eduardo Martin Rojo , Daljit Roopra, Mark Rose, Luke Rudd, Ramin Sadri, Nicholas Salmon, David Saul, Frank Schwach, Carol Scott, Phil Seekings, Lesley Shirley, John Sillitoe, Alison Simms, Matt Sinnott, Shanthi Sivadasan, Bart Siwek, Dale Sizer, Kenneth Skeldon, Jason Skelton, Joanna Slater-Tunstill, Lisa Sloper, Nathalie Smerdon, Chris Smith, Christen Smith, James Smith, Katie Smith, Michelle Smith, Sean Smith, Tina Smith, Leighton Sneade, Carmen Diaz Soria, Catarina Sousa, Emily Souster, Andrew Sparkes, Michael Spencer-Chapman, Janet Squares, Robert Stanley, Claire Steed, Tim Stickland, Ian Still, Mike Stratton, Michelle Strickland, Allen Swann, Agnieszka Swiatkowska, Neil Sycamore, Emma Swift, Edward Symons, Suzanne Szluha, Emma Taluy, Nunu Tao, Katy Taylor, Sam Taylor, Stacey Thompson, Mark Thompson, Mark Thomson, Nicholas Thomson, Scott Thurston, Gerry Tonkin-Hill, Dee Toombs, Benjamin Topping, Jaime Tovar-Corona, Daniel Ungureanu, James Uphill, Jana Urbanova, Philip Jansen Van, Valerie Vancollie, Paul Voak, Danielle Walker, Matthew Walker, Matt Waller, Gary Ward, Charlie Weatherhogg, Niki Webb, Danni Weldon, Alan Wells, Eloise Wells, Luke Westwood, Theo Whipp, Thomas Whiteley, Georgia Whitton, Andrew Whitwham , Sara Widaa, Mia Williams, Mark Wilson und Sean Wright

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RKG, SAK, DAC, AS, TG und EG-K. konzipierte die Studie. Von RKG, SAK, DAC, LEM, JAGB, EG-K., NT, A. Chandra, CS, RD, RAG, DDP und YM entworfene Experimente. SAK, DAC, LEM, RD, CR-S., AJ, IATMF, KS, TG, CJRI, JRB, JPS, MJvG, LG-C., GB-M. und KL führten Experimente durch. RKG, SAK, DAC, PM, LEM, JAGB, SG, KS, TG, JB, KGCS, IGG, CJRI, IUL, DJR, JPS, JRB, RAG, DDP, RD, LC-G. und GB-M. interpretierte Daten. RKG, DAC und SAK haben den ersten Entwurf des Papiers verfasst. Alle Autoren haben zur Überarbeitung des Papiers beigetragen.

Korrespondenz mit Ravindra K. Gupta.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Informationen zum Peer-Review Nature dankt Richard Neher und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

CPAP, kontinuierlicher positiver Atemwegsdruck; CT, Zyklusschwelle; ITU, Intensivtherapieeinheit.

a: Die Anzahl der weißen Blutkörperchen (WCC) und der Lymphozyten wird mit 103 Zellen pro mm3 ausgedrückt. CRP, C-reaktives Protein. b, Beurteilung der T-Zellen- und angeborenen Funktion. Zytokine wurden im Vollblut nach 24-stündiger Stimulation entweder nach T-Zell-Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) oder Anti-CD3/IL2-Antikörpern oder nach angeborener Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) gemessen. Daten von gesunden Kontrollpersonen sind als graue Kreise dargestellt (n = 15), Daten von Patient X1 an den Tagen 71 und 98 sind als blaue bzw. rote Kreise dargestellt. Die Zytokinwerte werden in pg ml−1 angegeben. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Quelldaten

a, Anti-SARS-CoV-2-IgG-Antikörper bei Patient Rote, graue und goldene IgG-Antikörper gegen das Nukleokapsid (N)-Protein, das trimere Spike (S)-Protein und die RBD von SARS-CoV-2 wurden mittels multiplexer partikelbasierter Durchflusszytometrie (Luminex) bei RNA+-Patienten mit COVID-19 gemessen ( n = 20, rote Punkte), gesunde Kontrollpersonen aus der Zeit vor der Pandemie (n = 20, graue Punkte) und rekonvaleszierendes Spenderplasma (orange Punkte). Patientenseren im Zeitverlauf sind blau dargestellt: Anti-SARS-CoV-2-IgG gegen Nukleokapsid (blaue Quadrate), Spike (blaue Kreise) und RBD (blaue Dreiecke). Bei den Daten handelt es sich um mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ± Standardabweichung. Der Zeitpunkt der Rekonvaleszenz-Plasmaeinheiten (Tage nach dem ersten positiven Test) wird ebenfalls angezeigt. b, SARS-CoV-2-Antikörpertiter im Rekonvaleszenzplasma. Messung der SARS-CoV-2-spezifischen IgG-Antikörpertiter in drei Einheiten Rekonvaleszenzplasma mittels Euroimmun-Assay. OD, optische Dichte.

Quelldaten

a, Vergleich zwischen Short-Read- (Illumina) und Long-Read-Einzelmolekül-Sequenzierungsmethoden (Oxford Nanopore) für die sechs beobachteten Mutationen im Spike-Protein. Die Übereinstimmung war im Allgemeinen zwischen den meisten Zeitpunkten gut; Aufgrund der großen Diskrepanzen bei mehreren Zeitpunkten schlagen wir jedoch vor, dass die Nanopore-Methode aufgrund der hohen Base-Calling-Fehlerrate noch nicht zum Aufrufen von Minderheitsvarianten geeignet ist. Daher wurden alle Zahlen im Hauptpapier ausschließlich anhand der Illumina-Daten erstellt. b, Einzelgenom-Sequenzierungsdaten aus Atemwegsproben an den angegebenen Tagen. Die Anzahl der zu jedem Zeitpunkt erhaltenen Einzelgenome mit den interessierenden Mutationen (identifiziert durch Tiefensequenzierung) wird angezeigt. *Der Nenner ist 19, da die Primerablesungen für zwei Proben an Tag 98 bei Aminosäure 796 von schlechter Qualität waren. Aminosäurevariante und entsprechende Nukleotidposition: Spike(W64G), 21752; Spitze (Δ69), 21765–21770; Spitze (Y200H), 22160; Spitze (T240I), 22281; Spitze (P330S), 22550; Spitze (D795H), 23948.

Quelldaten

a: Paarweise Abstände zwischen Proben, gemessen unter Verwendung der All-Locus-Abstandsmetrik, aufgetragen gegen die paarweisen zeitlichen Abstände (gemessen in Tagen) zwischen den gesammelten Proben. Interne Abstände zwischen Proben in der vorgeschlagenen Hauptgruppe werden in Schwarz angezeigt, Abstände zwischen Proben in der Hauptgruppe und an den Tagen 93 und 95 gesammelten Proben werden in Rot angezeigt und interne Abstände zwischen Proben, die an den Tagen 93 und 95 gesammelt werden, werden in Grün angezeigt. b, Paarweise Abstände zwischen Proben in der größeren Gruppe (schwarz) und zwischen diesen Proben und denen, die an den Tagen 93 und 95 gesammelt wurden (rot). Die Medianwerte der Verteilungen dieser Werte unterscheiden sich laut einem Mann-Whitney-U-Test deutlich. c, Paarweise Abstände zwischen Proben in der Hauptgruppe, nachdem die an den Tagen 86, 89, 93 und 95 gesammelten Daten entfernt wurden (schwarz) und zwischen diesen Proben und denen, die an den Tagen 86 und 89 gesammelt wurden (rot). Die Medianwerte der Verteilungen dieser Werte unterscheiden sich laut einem Mann-Whitney-U-Test auf dem 5 %-Niveau nicht signifikant.

a, Vergrößerte Ansicht des phylogenetischen Maximum-Likelihood-Baums, der die Diversität von Patient ,5 (Orange und Gold). Kontrollpatienten mit SARS-CoV-2 zeigten im Allgemeinen eine zeitlich begrenzte Diversität, obwohl die Sequenzen aus einer der vorherigen Studien4 stark divergierten. Umgebungsproben (Klingel und Mobiltelefon des Patienten) werden angezeigt. Baumzweige wurden eingestürzt, wenn die Bootstrap-Unterstützung <60 war. b, Highlighter-Diagramm, das die Nukleotidveränderungen auf Konsensniveau in aufeinanderfolgenden Atemwegsproben im Vergleich zur Konsenssequenz bei der Erstdiagnose von COVID-19 zeigt. Jede Zeile gibt den Zeitpunkt der Probenentnahme an (Anzahl der Tage nach dem ersten positiven RT-qPCR-Ergebnis für SARS-CoV-2). Schwarze gestrichelte Linien zeigen die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) und die Spike-Regionen des Genoms. Zwischen Tag 1 und 54 kam es zu wenigen Nukleotidsubstitutionen, obwohl der Patient zwei Zyklen Remdesivir erhielt. Die ersten größeren Veränderungen im Spike-Genom traten am 82. Tag auf, nachdem an den Tagen 63 und 65 Rekonvaleszenzplasma verabreicht wurde. Die Aminosäuredeletion in S1 (ΔH69/ΔV70) wird durch die schwarzen Linien angezeigt. Zu den Probenorten gehörten Endotrachealaspirate (ETA) sowie Nasen- und Rachenabstriche (N+T).

a, Infektion von HEK293T-Zielzellen, die TMPRSS2- und ACE2-Rezeptoren exprimieren, unter Verwendung gleicher Virusmengen, bestimmt durch Reverse-Transkriptase-Aktivität. Datenpunkte sind Mittelwerte ± Standardabweichung. von technischen Replikaten (n = 2); Die Daten sind repräsentativ für n = 2 unabhängige Experimente. b, Repräsentative inverse Verdünnungsdiagramme für Spike-Varianten gegen Rekonvaleszenzplasmaeinheiten 1–3. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung der Neutralisierung technischer Replikate (n = 2). Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente (n = 2).

Quelldaten

a: Mit dem Spike-Protein (Wildtyp (WT) (D614G-Hintergrund), D796H, ΔH69/ΔV70, D796H + ΔH69/ΔV70) von SARS-CoV-2 pseudotypisierte Lentiviren wurden in HEK293T-Zellen produziert und zur stabilen Infektion von Hela-Zielzellen verwendet Expression von ACE2 in Gegenwart serieller Verdünnungen der angegebenen monoklonalen Antikörper (mAb). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 2 technischen Replikaten. Die Daten sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. b: Klassen von RBD-bindenden Antikörpern und Faltungsänderungen für die Spike-Mutationen D796H oder ΔH69/ΔV70 sind in einer zuvor veröffentlichten Studie angegeben50. Die Cluster II und V enthalten nur nicht neutralisierende monoklonale Antikörper; Die kleineren neutralisierenden monoklonalen Antikörpercluster IV (n = 2) und X (n = 1) wurden nicht getestet. Rot weist auf signifikante Faltveränderungen hin.

Quelldaten

a, Das SARS-CoV-2-Spike-Trimer (PDB-ID: 6XR8) mit zwei Protomeren, dargestellt als Oberflächen und einem Protomer, dargestellt als Band. Die NTD ist in Hellblau, die RBD in Hellrosa, das Fusionspeptid in Dunkelrosa, die HR1-Domäne in Gelb, die CH-Domäne in Hellgrün und die CD-Domäne in Braun gefärbt. Die Standorte von D796 und H69 werden durch rote Kugeln angezeigt. Die Schleife, die D796 mit dem Fusionspeptid verbindet, ist zur besseren Sichtbarkeit magentafarben. Die doppelten grauen Linien dienen zur Orientierung relativ zur Membran. b, Vergrößerung des Bereichs, der durch das Kästchen um H69 in a definiert wird. H69 ist gelb hervorgehoben. Rückstände, die Atome enthalten, die innerhalb von 6 Å von H69 entfernt sind, werden in Cyan hervorgehoben. c, Vergrößerung des durch den Kasten um D796 in a definierten Bereichs. D796 ist gelb hervorgehoben. Rückstände, die Atome enthalten, die innerhalb von 6 Å von D796 liegen, werden in Cyan hervorgehoben. Wasserstoffbrückenbindungen werden durch gestrichelte gelbe Linien angezeigt. Hydrophobe Rückstände in der Nähe von D796 wurden markiert. Y707 stammt vom benachbarten Protomer. d, Globale Prävalenz ausgewählter Spike-Mutationen, die in diesem Artikel beschrieben werden. Alle Sequenzen mit hoher Abdeckung wurden am 6. Januar 2021 aus der GISAID-Datenbank heruntergeladen und mit MAFFT abgeglichen; Zu diesem Zeitpunkt waren 298.254 Sequenzen verfügbar. Die globale Prävalenz jeder der sechs Spike-Varianten (W64G, ΔH69/ΔV70, Y200H, T240I, P330S und D796H) wurde durch Anzeigen des Mehrfachsequenz-Alignments in AliView, Sortieren nach der interessierenden Spalte und Zählen der Anzahl der Mutationen bewertet.

Eine vollständige Liste der Mitglieder der CITIID-NIHR BioResource COVID-19 Collaboration.

Diese Datei enthält ergänzende klinische Falldetails, ergänzende Tabellen 1–4 und ergänzende Abbildungen 1–2.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kemp, SA, Collier, DA, Datir, RP et al. SARS-CoV-2-Entwicklung während der Behandlung chronischer Infektionen. Natur 592, 277–282 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03291-y

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Eingegangen: 01. Dezember 2020

Angenommen: 26. Januar 2021

Veröffentlicht: 05. Februar 2021

Ausgabedatum: 08. April 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03291-y

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